Immuunblot on positiivne. HIV-positiivne immunoblotanalüüs

Immuunblotanalüüs (immunoblot, Western blot, Western blot)- ühendab ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) viiruse antigeenide eelneva elektroforeetilise ülekandega nitrotselluloosi ribale (ribale).

Selles ilusas teaduslikus nimes tõlgitakse "blot" tõenäoliselt kui "blot" ja "western" kui "western" peegeldab selle "bloti" leviku suunda paberil vasakult paremale, see tähendab geograafilisel kaardil, see vastab suunale läänest itta. "Immuunblot" meetodi olemus seisneb selles, et ensüümiga seotud immunosorbentreaktsioon viiakse läbi mitte antigeenide seguga, vaid HIV-antigeenidega, mis on eelnevalt immunoforeesi teel jaotatud fraktsioonideks, mis paiknevad vastavalt molekulmassile nitrotselluloosmembraani pinnal. . Selle tulemusena jaotuvad peamised HIV-valgud, antigeensete determinantide kandjad, pinnale eraldi ribadena, mis ilmnevad ensüümi immuunanalüüsi käigus.

Immunoblot sisaldab mitut etappi:

Riba ettevalmistamine. Immuunpuudulikkuse viirus (HIV), mis on eelnevalt puhastatud ja selle koostisosadeks hävitatud, allutatakse elektroforeesile, samas kui HIV-i moodustavad antigeenid eraldatakse molekulmassi järgi. Seejärel kantakse blotimisega (analoogselt "blotteril" liigse tindi väljapressimisele) antigeenid üle nitrotselluloosi ribale, mis sisaldab nüüd HIV-le iseloomulike, silmale nähtamatute antigeensete ribade spektrit.

Näidisuuring. Uuritav materjal (patsiendi seerum, vereplasma jne) kantakse nitrotselluloosi ribale ja kui proovis on spetsiifilised antikehad, siis need seostuvad rangelt vastavate (komplementaarsete) antigeensete ribadega. Järgnevate manipulatsioonide tulemusena selle interaktsiooni tulemus visualiseeritakse – tehakse nähtavaks.

Tulemuse tõlgendamine. Ribade olemasolu nitrotselluloosplaadi teatud piirkondades kinnitab rangelt määratletud HIV antigeenide vastaste antikehade olemasolu uuritud seerumis.

Rada A – positiivne juhtimine

Rada B – nõrk positiivne kontroll

Rada C – negatiivne kontroll

Riba D – positiivne proov (tuvastatud HIV-1 antikehad)

Praegu on immuunblotanalüüs (immunoblot) peamine meetod viirusspetsiifiliste antikehade olemasolu kinnitamiseks uuritavas seerumis. Mõnel HIV-nakkuse korral tuvastatakse meetodiga spetsiifilised antikehad tõhusamalt enne serokonversiooni tekkimist. immuunbloteerimine kui ELISA. Immuunblotanalüüs näitas, et gp 41 vastaseid antikehi tuvastatakse kõige sagedamini AIDS-i patsientide seerumis ning profülaktilistel eesmärkidel uuritud isikutel p24 tuvastamine nõuab täiendavaid uuringuid HIV-nakkuse tuvastamiseks. Geneetiliselt muundatud rekombinantsetel valkudel põhinevad immuunblot-testisüsteemid osutusid spetsiifilisemaks kui tavalised puhastatud viiruslüsaadil põhinevad süsteemid. Rekombinantse antigeeni kasutamisel ei moodustu mitte difuusne, vaid selgelt piiritletud kitsas antigeeniriba, mis on arvestuseks ja hindamiseks kergesti ligipääsetav.

HIV-1-ga nakatunud isikute seerum, tuvastada järgmiste peamiste valkude ja glükoproteiinide antikehad - struktuursed ümbrise valgud (env) - gp160, gp120, gp41; tuumad (gag) - p17, p24, p55, samuti viiruse ensüümid (pol) - p31, p51, p66. HIV-2 puhul on tüüpilised env-vastased antikehad - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol-p68.

Reaktsiooni spetsiifilisuse kindlakstegemiseks vajalike laboratoorsete meetodite hulgas on suurim tunnustus HIV-1 ümbrisvalkude - gp41, gp120, gp160 ja HIV-2 - gp36, gp105, gp140 antikehade tuvastamisel.

WHO loeb seerumi positiivseks, kui immunoblotanalüüsiga tuvastatakse antikehad mis tahes kahe HIV glükoproteiini vastu. Nende soovituste kohaselt, kui reaktsioon toimub ainult ühe ümbrisvalguga (rp 160, rp 120, rp 41) kombinatsioonis või ilma reaktsioonita teiste valkudega, peetakse tulemust kahtlaseks ja soovitatakse teha teist katset, kasutades komplekti. mõnest teisest sarjast või mõnest teisest firmast. Kui pärast seda jääb tulemus kahtlane, on soovitatav jälgida 6 kuud (uuring 3 kuu pärast).

Positiivse reaktsiooni olemasolu p24 antigeeniga võib viidata serokonversiooni perioodile, kuna selle valgu vastased antikehad ilmuvad mõnikord esimesena. Sel juhul on soovitav, olenevalt kliinilistest ja epidemioloogilistest andmetest, korrata uuringut vähemalt 2 nädalat hiljem võetud seerumiprooviga ja just seda juhul, kui HIV-nakkuse korral on vaja paariseerumit.

Positiivsed reaktsioonid gag- ja pol-valkudega ilma reaktsioonita env-valkudega võivad kajastada varase serokonversiooni staadiumit ja samuti viidata HIV-2 infektsioonile või mittespetsiifilisele reaktsioonile. Isikud, kellel on sellised tulemused pärast HIV-2 testimist, vaadatakse uuesti 3 kuu pärast (6 kuu jooksul).

Immunoblot sisaldab mitut etappi:

Tulemuse tõlgendamine. Ribade olemasolu nitrotselluloosplaadi teatud piirkondades kinnitab rangelt määratletud HIV antigeenide vastaste antikehade olemasolu uuritud seerumis.

Rada A – positiivne juhtimine

Rada B – nõrk positiivne kontroll

Rada C – negatiivne kontroll

Riba D – positiivne proov (tuvastatud HIV-1 antikehad)

Praegu on immuunblotanalüüs (immunoblot) peamine meetod viirusspetsiifiliste antikehade olemasolu kinnitamiseks uuritavas seerumis. Mõnedel HIV-nakkuse juhtudel tuvastatakse spetsiifilised antikehad enne serokonversiooni tõhusamalt immunoblotanalüüsiga kui ELISA-ga. Immuunblotanalüüs näitas, et gp 41 vastaseid antikehi tuvastatakse kõige sagedamini AIDS-i patsientide seerumis ning profülaktilistel eesmärkidel uuritud isikutel p24 tuvastamine nõuab täiendavaid uuringuid HIV-nakkuse tuvastamiseks. Geneetiliselt muundatud rekombinantsetel valkudel põhinevad immuunblot-testisüsteemid osutusid spetsiifilisemaks kui tavalised puhastatud viiruslüsaadil põhinevad süsteemid. Rekombinantse antigeeni kasutamisel ei moodustu mitte difuusne, vaid selgelt piiritletud kitsas antigeeniriba, mis on arvestuseks ja hindamiseks kergesti ligipääsetav.

Mis see on - immunoblot? See on levinud meetod laboratoorne diagnostika viirusnakkused isik. Seda peetakse üheks kõige täpsemaks ja usaldusväärsemaks viisiks HIV-nakkuse tuvastamiseks. Oma usaldusväärsuse poolest ületab see isegi immunobloti tulemusi, mida peetakse ümberlükkamatuteks ja lõplikeks.

Üldine informatsioon

Immunoblot - mis see on? Inimesel HIV-nakkuse äratundmiseks on vaja läbida vereseerumi laborianalüüs antikehade esinemise suhtes. Western blot meetodit nimetatakse ka Western blot'iks. Seda kasutatakse täiendava ekspertmeetodina inimese viirusnakkuste tuvastamiseks. On vaja kinnitada ELISA - laborianalüüs, mis võimaldab teil määrata HIV-antikehade olemasolu veres. Positiivne ELISA analüüs kontrollitakse uuesti immunoblotanalüüsiga. Seda peetakse kõige tundlikumaks, keerukamaks ja kallimaks.

eesmärk

Mis see on - immunoblot? See on meetod vereseerumi laboratoorseks testimiseks viirusevastaste antikehade tuvastamiseks. Uuringu käigus eraldab spetsialist eelnevalt geelis olevad viiruse valgud ja kannab need nitrotselluloosmembraanile. Immunoblotanalüüsi protseduur on ette nähtud HIV määramiseks erinevad etapid. Esimeses etapis allutatakse selle koostisosadest puhastatud viirusele elektroforees ja selle koostise moodustavad antigeenid eraldatakse molekulmassi järgi.

See paljuneb elusrakus, sisestades sellesse oma geneetilise teabe. Selles etapis saab inimene HI-viiruse kandjaks, kui ta oli nakatunud. Haiguse eripära on see, et see ei pruugi pikka aega avalduda. Viirus hävitab lümfotsüüte, mistõttu inimese immuunsus väheneb ja organism ei suuda infektsioonidele vastu seista. Kui HIV-i ravitakse asjatundlikult ja õigeaegselt, elab patsient küpse vanaduseni. Teraapia puudumine viib paratamatult surmani. Alates nakatumise hetkest, kuid ilma ravita, ei ole maksimaalne eluiga üle kümne aasta.

Iseärasused

Immunoblotanalüüs on usaldusväärne meetod, mis võimaldab teil määrata esimest ja teist tüüpi HIV-antigeenide vastaste antikehade olemasolu. Kui inimene on nakatunud, tekivad kahe nädala jooksul antikehad, mida saab tuvastada palju hiljem. HIV-i eripära on see, et antikehade arv suureneb kiiresti ja jääb patsiendi verre. Isegi kui need on olemas, ei pruugi haigus avalduda kahe või enama aasta jooksul. ELISA meetod ei määra alati haiguse esinemist täpselt, seetõttu on ensüümi immuunanalüüsi positiivse tulemuse korral vajalik tulemuste kinnitamine immunoblotanalüüsi ja PCR abil.

Näidustused kohtumiseks

Mis see "immunoblot" on, on juba välja selgitatud, kuid kellele see on ette nähtud see uuring? Immunoblotanalüüsi meetodi testide võtmise põhjus on positiivne ELISA tulemus. Patsientidel, keda opereeritakse, on vaja läbida ensüümi immuunanalüüs. Lisaks tuleks analüüs teha nii rasedust planeerivatele naistele kui ka kõigile, kes on promiskuidsed. seksuaalelu. Kui ELISA tulemused kahtlevad, määrake HIV-ga patsientidele immunoblotanalüüs. Arsti poole pöördumise põhjuseks võivad olla järgmised murettekitavad sümptomid:

järsk kaalulangus;
nõrkus, töövõime kaotus;
soolehäire (kõhulahtisus), mis kestab kolm nädalat;
keha dehüdratsioon;
palavik;
suurendama lümfisõlmed kehal;
kandidoosi, tuberkuloosi, kopsupõletiku, toksoplasmoosi areng, herpese ägenemine.

Patsient ei pea enne veenivere loovutamist valmistuma. 8-10 tundi enne uuringut ei saa te süüa. Päev enne vereloovutamist ei ole soovitatav juua alkohoolseid ja kohvijooke, tegeleda raskete füüsiliste harjutustega, kogeda põnevust.

Kus analüüsi teha?

Kus saab HIV-testi teha? ELISA, immunoblotuuringud viiakse läbi linna erakliinikutes, tulemused väljastatakse päeva jooksul. Võimalik on ka kohene diagnoos. Riiklikes meditsiiniasutustes tehakse ELISA-testid ja immunoblotanalüüs vastavalt Vene Föderatsiooni õigusaktidele tasuta. Rasedad naised, samuti patsiendid, kes peavad olema haiglaravil või kellele tehakse operatsioon, peavad läbima nakkushaiguste testi.

Kuidas uuringut tehakse?

Kuidas ELISA-d tehakse? Immunoblot positiivne/negatiivne kinnitab või lükkab ümber ensüümi immuunanalüüsi tulemused. Uurimisprotseduur on üsna lihtne. Spetsialist viib läbi venoosse vereproovi, ajaliselt ei kulu see rohkem kui viis minutit. Pärast proovi võtmist tuleb süstekoht desinfitseerida ja sulgeda plaastriga. Proovide võtmine toimub tühja kõhuga, nii et pärast protseduuri ei tee paha süüa tahvel tumedat šokolaadi ega juua magusat kuuma jooki.

Osariigis tasuta analüüsi saatekirja saamiseks raviasutus peate külastama üldarsti. Üldiselt ei erine immunoblot proovivõtumeetodi poolest teistest vereanalüüsidest. Uurimismetoodika on lihtne. Kui viirus on inimese veres, hakkab organism selle hävitamiseks tootma antikehi. Igal viirusel on oma antigeenivalkude komplekt. Nende antikehade tuvastamine on Western blot meetodi aluseks.

Hind

Kui palju analüüs maksab? HIV-i immunoblot ei kehti odavate uuringute puhul. Keskmiselt maksab sõeluuring ensüümi immuunanalüüsiga 500 kuni 900 rubla. Immunoblotanalüüs on kontrolluuring, mille maksumus on kolm kuni viis tuhat rubla. Keerulisemad meetodid on palju kallimad. Näiteks peate selle eest maksma umbes 12 000 rubla.

Tulemuse tõlgendamine

Kõige tavalisemad HIV-nakkuse diagnoosimise meetodid on ensüümi immunoanalüüs ja immunoblot. Neid kasutatakse immuunpuudulikkuse viiruse vastaste seerumi antikehade määramiseks. Nakkuse olemasolu kinnitatakse tavaliselt kahe testiga: sõeluuring ja kinnitav. Uuringu tulemuste tõlgendamise peaks läbi viima arst, ta paneb ka diagnoosi ja määrab ravi. Kui immunoblot on positiivne, tähendab see, et inimkehas on viirus.

Positiivne tulemus ei tohiks olla eneseravi põhjuseks, kuna igal patsiendil võib olla haigusest oma pilt. Kvalitatiivne analüüs sisaldab läbivaatust ja kontrollimist. Kui patsiendil viirust pole, märgitakse tulemus negatiivseks. Sõeluuringumeetodiga tuvastamisel viiakse läbi täiendav kontrolluuring. Immunoblot on analüüs, mis kinnitab või lükkab ümber sõeluuringu. Kui testribale ilmub teatud piirkondades (valgu lokaliseerimise kohtades) tumenemine, tehakse HIV-diagnoos. Kui tulemused kahtlevad, tehakse testid kolme kuu jooksul.

Immuunpuudulikkuse viirusega nakatumist saate vältida, kui järgite teatud reegleid: vältige juhuseksi, kasutage kontaktide ajal kondoomi, ärge võtke ravimeid. Kui haigus avastatakse rasedal naisel, on oluline rangelt järgida raviarsti soovitusi, ärge unustage läbida viiruse olemasolu uuringuid.

Nakkushaiguste laboratoorse diagnostika praktikas on mõnikord vaja määrata antikehi mitte patogeeni üldiselt, vaid teatud selle valkude (antigeenide) suhtes, see tähendab spetsiifiliste antikehade spektrit. Kui selleks kasutatakse ensüümseotud immunosorbentanalüüsi meetodit, siis on sel juhul vaja patogeeni kultuurist eraldada ja puhastada vajalikud antigeenid. Saadud valgud kantakse tahkele faasile eraldi. 96 süvendiga plaadi kasutamise korral - igas süvendis ühte tüüpi antigeen. Seejärel määratakse spetsiifilised antikehad kaudse meetodiga.

Positiivse reaktsiooni olemasolul süvendis ühe või teise antigeeniga saab hinnata vastavate spetsiifiliste antikehade olemasolu. Selliseid ensüümi immuunanalüüsi testsüsteeme pakuvad tootjad, kuid tänu suuremale teabesisaldusele ja uuringu enda teostamise lihtsusele on immuunblotanalüüs (Western blot) muutunud laialt levinud.

Immuunblotanalüüs võimaldab määrata vereseerumis antikehi üheaegselt ja samal ajal kõigist diagnostilistest testidest erinevalt. olulised valgud patogeen. Tõlge inglise keelest Western blot tähendab westerni ülekannet (sõna-sõnalt - blot). Selle ebatavalise termini ajalugu on järgmine.

Teadlane nimega Southern (E. Southern) pakkus 1975. aastal esimest korda välja meetodi elektroforeetiliselt eraldatud DNA fragmentide ülekandmiseks geelist membraanile. Autori sõnul nimetati seda meetodit Southern blot, mis tähendab "lõunasiiret". RNA molekulide ülekandmise meetodit kutsusid spetsialistid omakorda hüüdnimeks Northern blot - "northern transfer". Algul naljana ja siis fikseeriti see nimi ametlikus teaduskirjanduses.

G. Toubin avaldas 1979. aastal valgublotanalüüsi esimeste katsete tulemused. Jätkates bioloogiliste makromolekulide ülekandmise meetodite "geograafiliste" nimetuste traditsioone, sai see meetod tuntuks "lääne" ülekandena - Western blot.

Selle meetodi esimeses etapis viiakse läbi patogeensete valkude segu elektroforeetiline eraldamine polüakrüülamiidgeelis naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) juuresolekul. SDS, olles pealiskaudne toimeaine, ümbritseb ühtlaselt valgumolekule ja annab neile kõigile ligikaudu võrdse suurusega negatiivse laengu. Seetõttu liiguvad molekulid elektriväljas ühes suunas ja liikumise kiirus sõltub ainult valgu molekuli suurusest (molekulmassist).

Elektroforeetilise protseduuri tulemusena saadakse geelplaat, mille paksuses paiknevad valgud eraldi õhukeste lineaarsete tsoonide kujul. Liikumissuunas jagunevad need järgmises järjekorras: suure molekulmassiga, umbes 120-150 kDa valgud on stardile lähemal ja 5-10 kDa massiga valgud on edasi jõudnud finišisse. Teises etapis asetatakse geelplaat nitrotselluloosi lehele ja see struktuur asetatakse alalisvooluallika elektroodide vahele. Elektrivälja toimel voolavad valgud poorsest geelist tihedamale membraanile, kus need on kindlalt fikseeritud.

Saadud blotti töödeldakse blokeeriva lahusega, mis sisaldab antigeenselt ükskõikseid valke ja/või mitteioonseid detergente (Tween 20), mis blokeerivad membraani antigeenivabu kohti. Seejärel lõigatakse membraanileht kitsasteks ribadeks, nii et iga riba sisaldab kõiki antigeenseid fraktsioone. Kirjeldatud sammud viib läbi tootja.

Kaubanduslikud testisüsteemid antikehade tuvastamiseks immuunblotanalüüsi abil sisaldavad analüüsiks valmis blotte (ribasid või ribasid). Kasutaja määrab patogeeni valkude spetsiifiliste antikehade kogu spektri vastavalt kaudse meetodi skeemile. Kromogeenina värvilise (ensümaatilise) reaktsiooni läbiviimiseks kasutatakse lahustuvat värvitut ainet, mille saadus omandab värvuse, muutub lahustumatuks ja settib (sadeneb) nitrotselluloosile.

Järjestikuste immuun- ja ensümaatiliste reaktsioonide tulemusena patogeeni valkude vastaste antikehade olemasolul uuritavas proovis tekivad blotile tumedad põikitriibud, mille asukoht on teatud patogeensete valkude tsoonis. Iga selline riba näitab vastava antigeeni spetsiifiliste antikehade olemasolu. Immuunblotanalüüsi meetodil tehtud uuringu tulemus väljastatakse patogeeni spetsiifiliste valkude vastaste antikehade loeteluna. Näiteks: "tuvastati p17 ja p24 valkude vastased antikehad."

Nitrotselluloosi blotte saab pärast väljatöötamist säilitada kuivatatud kujul pikka aega. Värvi intensiivsus on aga oluliselt nõrgenenud. Märgblotte saab pildistada või skannerite abil nende graafilise pildi personaalarvutite mällu sisestada. Spetsiaalsed arvutiprogrammid võimaldavad teil tulemusi töödelda ja dünaamilise jälgimise ajal kiiresti jälgida antikehade spektri dünaamikat

immunoblotanalüüs -(inglise keelest "blot" - spot) - meetod antigeenide (või antikehade) tuvastamiseks tuntud seerumite (või antigeenide) abil. See on geelelektroforeesi ja ELISA kombinatsioon. Algselt hävitatakse ultraheli abil bakterirakud või virioonid, seejärel eraldatakse kõik viiruse või bakterirakkude antigeenid elektroforeesiga ning saadakse kaubanduslik reagent spetsiaalsel nitrotsellulooskilel. Immunoblotimise seadistamisel kantakse patsiendi uuritav seerum teadaolevate antigeenidega kilele. Pärast inkubeerimist ja seondumata antikehade mahapesemist jätkatakse ELISA-ga – kilele kantakse ensüümiga märgistatud inimese immunoglobuliinide antiseerum ja kromogeenne substraat, mis muudab ensüümiga suhtlemisel värvi. Immunoglobuliini-ensüümi komplekside antigeen-antikeha-antiseerumi juuresolekul tekivad kandjale värvilised laigud. Immunoblotimise meetod võimaldab teil eraldi tuvastada patogeeni erinevate antigeenide vastaseid antikehi (näiteks HIV-nakkuse korral tuvastab immunoblotanalüüs gp120, gp24 ja teiste viiruse antigeenide vastaseid antikehi).

Radioimmunoanalüüs (RIA)

Meetod põhineb antigeen-antikeha reaktsioonil, kasutades antigeeni või antikeha märgist koos radionukliidiga. Märgisena kasutatakse 125I, 14C, 3H, 51Cr ja teisi radionukliide. Saadud immuunkompleksid eraldatakse süsteemist ja nende radioaktiivsus määratakse loenduritel (β-kiirgus). Kiirguse intensiivsus on otseselt võrdeline seotud antigeeni ja antikeha molekulide arvuga.

Laialdaselt kasutatakse RIA tahkefaasilist versiooni, mis kasutab märgistatud antikehi või antigeene, mis on adsorbeeritud polüstüreenpaneelide süvenditesse.

RIA-d kasutatakse mikroobide, viiruste, erinevate hormoonide, ensüümide, ravimainete, immunoglobuliinide, aga ka teiste uuritavas materjalis sisalduvate ainete tuvastamiseks väiksemates kontsentratsioonides 10–12–10–15 g/l.

testi küsimused

Immuunse bakteriolüüsi reaktsioon: milline reaktsioon see on? mis on antigeen, mis on antikeha, reaktsioonimehhanism, lavastusmeetodid, praktiline kasutamine. Immuunse hemolüüsi reaktsioon: vajalikud koostisosad, seadistusviis; juhtnupud, praktiline rakendamine. Lokaalse hemolüüsi reaktsioon geelis (Yerne'i reaktsioon): reaktsiooni põhimõte, koostise meetod, praktiline rakendus. Komplemendi fikseerimise reaktsioon: reaktsiooni põhimõte; mis tekib immuunseerumi interaktsioonil spetsiifilise antigeeniga; mis juhtub täiendusega, kui see on selles interaktsioonis olemas? Milline on komplemendi saatus, kui antigeeni ja antikehade vahel puudub spetsiifiline afiinsus? Millise reaktsiooni abil saab kindlaks teha, mis komplemendiga juhtus; miks seda reaktsiooni kasutatakse; mis on RSK nähtav positiivne tulemus? Miks? Millist komplemendi omadust kasutatakse CSC esimeses faasis? Teises faasis? Kui RSK lõpptulemus on hemolüüs, kas see tähendab positiivset või negatiivset tulemust? Selgitage tulemusi: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Nimetage esimese RSK süsteemi koostisosad ja teise RSK süsteemi koostisosad. Miks on vaja testitav seerum inaktiveerida? Kuidas komplementi tiitritakse? Hemolüütiline seerum: mida see sisaldab, kuidas seda saadakse, mis on tiiter ja kuidas seda määratakse? Milliseid loomi kasutatakse RSC komponentide saamiseks? RSC külmas seadmise tehnika. Milliste järgmiste reaktsioonide etapis on vajalik komplemendi osalemine: sadestumine, flokulatsioon, aglutinatsioon, mittetäielike antikehade tuvastamine, immuunbakteriolüüs, immuunhemolüüs, Yerne, CSC? Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF) – näitab sündmuste jada otseses Coonsi reaktsioonis; vajalikke koostisosi. Mis on antigeen, mis on antikeha, kuidas antikehi märgistatakse, kuidas reaktsiooni tulemust arvestatakse, milline näeb välja positiivne tulemus? Praktiline rakendus – mida saab selle reaktsiooni abil kindlaks teha? Kaudne immunofluorestsentsreaktsioon - märkige selle reaktsiooni sündmuste jada, vajalikud koostisosad, mis on antigeen, milliseid immuunseerumeid kasutatakse; praktiline kasutamine; kaudse RIF-i eelis otsese reaktsiooni ees. Seotud immunosorbentanalüüs(ELISA) - reaktsiooni põhimõte; vajalikud koostisosad; näitama reaktsiooni käivitamisel sündmuste jada, et tuvastada uuritavas materjalis antigeen; vajalikud koostisosad; mis juhtub positiivse tulemusega, kuidas see välja näeb? Täpsustage ELISA toimingute järjestus, et tuvastada uuritavas seerumis olevad antikehad; vajalikud koostisosad; mis saab positiivse tulemusega? Immunoblotanalüüs - reaktsiooni põhimõte; peamised sammud; vajalikud koostisosad; Kuidas tulemust arvestatakse? reaktsiooni eelised. Radioimmunoanalüüs (RIA) - millised on reaktsiooni peamised etapid; millega märgistatakse antikehi või antigeene, kuidas tulemust arvestatakse? Immunoelektronmikroskoopia - meetodi põhimõte; peamised sammud; vajalikud koostisosad; Millega on antikehad märgistatud? kuidas reaktsiooni tulemust arvesse võetakse. Immobiliseerimisreaktsioonid - meetodi põhimõte, seadistamise tehnika, komponendid, tulemuste arvestamine.

Enesekoolituse käigus täidetavad ülesanded.

Selles teemas käsitletud reaktsioonide jaoks täitke immuunsusreaktsioonide tabel.

Immuunsed reaktsioonid

Õpilase tööd praktilises tunnis

Alustage kohe tööd RSC 1. etapi sõnastamisega, kuid kirjutage see hiljem märkmikusse (vt allpool).

1. Immuunse hemolüüsi reaktsioon. Vaadake immuunhemolüüsi demonstratsioonireaktsiooni, joonistage see diagrammina, selgitage tulemust katse- ja kontrollkatsutis.

2. Komplemendi sidumise reaktsioon

a) võtke RSC lahti vastavalt tabelile;

b) joonistage vihikusse tabeli kujul RSC seadistamise skeem;

c) pane RSK teine faas (esimene faas pannakse tunni algusesse);

d) demonteerida RSK jaoks vajalikud diagnostilised preparaadid;

e) võtta arvesse tulemust. Sõnastage järeldus spetsiifiliste antikehade olemasolu kohta uuritavas seerumis.

3. Immunofluorestsentsreaktsioon. Uurige tabelit, koostage vihikusse reaktsiooni seadistamise skeem; vaata diagnostilisi seerumeid; määrata, mida seerum sisaldab, kuidas seda valmistatakse, milliseks reaktsiooniks (otsene või kaudne RIF) seda kasutatakse. Vaadake RIF-i demonstratsiooni tulemust fluorestsentsmikroskoobis.

4. Ensüüm-immunoanalüüs (ELISA). Koostage oma märkmikus reaktsiooniskeem kahes versioonis: antigeeni tuvastamiseks uuritavas materjalis ja antikehade tuvastamiseks seerumis. Vaadake üle HIV ja B-hepatiidi diagnoosimise koostisosade komplekt. Tehke kindlaks, mida iga koostisosa sisaldab ja milleks seda kasutatakse.

5. Immunoblotanalüüs. Koostage oma märkmikusse reaktsiooni skeem; vaata demo – reaktsiooni tulemus.

6. Radioimmunoanalüüs (RIA). Joonistage oma vihikusse reaktsiooniskeem.

7. Immuunelektronmikroskoopia (IEM). Vaadake demonstratsiooni - reaktsiooni tulemust, koostage märkmikusse reaktsiooniskeem, märkige nooltega antigeen (viirus) ja märgistatud antikehad.

Immunoblotanalüüs on ülitundlik valgu tuvastamise meetod, mis põhineb elektroforeesi ja ELISA või RIA kombinatsioonil. Immunoblotimist kasutatakse kui diagnostiline meetod HIV-nakkusega jne.

Üldises mõttes mõistetakse immunoblotimist kui valkude segu analüüsimist, mis on kantud tahkele tugimembraanile, millega need seostuvad kovalentsete sidemetega, millele järgneb immuuntuvastus.

Otse substraadile sadestunud valkude segu (dot blot analüüs) või pärast selle esialgset fraktsioneerimist on võimalik analüüsida elektrofokuseerimise, ketaselektroforeesi või kahemõõtmelise elektroforeesi (Western blot) abil.

Patogeeni antigeenid eraldatakse polüakrüülamiidgeelelektroforeesiga, kantakse seejärel geelilt üle aktiveeritud paberile või nitrotselluloosmembraanile ja arendatakse ELISA abil.

Ettevõtted toodavad selliseid ribasid antigeenide "blotidega". Nendele ribadele kantakse patsiendi seerum. . Seejärel, pärast inkubeerimist, pestakse patsient patsiendi sidumata antikehadest ja kantakse ensüümiga märgistatud inimese immunoglobuliinide vastane seerum. . Ribale moodustunud kompleks (antigeen + patsiendi antikeha + inimese Ig vastane antikeha) tuvastatakse kromogeense substraadi lisamisega, mis muudab ensüümi toimel värvi.

Seda metoodikat rakendatakse ka bakterite, faagide või viiruste kloonide valikul, mis ekspresseerivad kloonitud sihtgeenide tooteid.

Valkude ülekandmine membraanile toimub kas passiivselt või kasutades elektrotransferaparaati. Valgu membraanile ülekandmise efektiivsust mõjutavad paljud tegurid, nagu valkude molekulmass, geeli poorsus, ülekandeaeg ja kasutatava puhverlahuse (transpuhvri) koostis.

Sõltuvalt katse ülesannetest ja tingimustest valitakse parimaid tulemusi andvad ülekandetingimused. Tavaliselt kasutatavad substraadid on nitrotselluloos, polüvinülideendifluoriid (PVDF) või positiivselt laetud nailonmembraanid. Nitrotselluloos suudab siduda kuni 80-100 mikrogrammi valku 1 cm2 kohta.

Madala molekulmassiga valgud (molekulmassiga alla 20 kDa) võivad pesemise tulemusena kaduda, mis võimaldab eelnevalt uurida teatud geneetiliste lookuste polümorfismi vastavate restriktsiooni-DNA fragmentide pikkuste järgi.

Lisaks on Southern hübridisatsiooni abil lihtne välja selgitada, kas sihtgeeni siseosas on teatud restriktsiooniensüümi poolt hüdrolüüsi koht, mis võimaldab valida uuritava genoomi piirkonna kloonimiseks optimaalse strateegia.

Sarnase skeemi järgi saab agaroosgeelist nitrotselluloosfiltrile üle kanda ka RNA molekule. Seda meetodit on kutsutud Northern blotting'iks, mitte Southern blotting'iks, kuna perekonnanimi Southern inglise keel tähendab "lõunamaa".

Valgugeelist filtritele ülekandmist nimetati vastavalt Western blot analüüsiks. Suured valgud (üle 100 kDa), mis on denatureeritud naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) lahuses, võivad membraanile halvasti kanduda, kui transpuhvris on etanool. Alkohol parandab oluliselt valkude ülekandumist SDS-polüakrüülamiidgeelist, kuid ahendab geelis olevaid poore, mis viib suurte valkude säilimiseni.

PVDF membraan on optimeeritud immuuntuvastuseks ja suudab säilitada spetsiifiliselt seotud valke kuni 160 µg/cm2 väga madala mittespetsiifilise seondumise tasemega.

Immunoblotanalüüs

Selle membraani oluline omadus on selle korduva kasutamise võimalus. Zeta-Probe nailonmembraanid seovad tõhusalt SDS-valke ilma alkoholita ja see seondumine on järgnevate töötluste suhtes vastupidav. Tõhusalt säilivad ka madala molekulmassiga valgud. Zeta-Probe membraanid, mis on suure seondumisvõimega ligikaudu 480 µg valku 1 cm2 kohta, suudavad tuvastada analüüsisegudes valgu jälgi.

Pärast antigeeni immobiliseerimist membraanile blokeeritakse ülejäänud seondumiskohad želatiini või veise seerumi albumiini või kooritud piima lahustega.

Seejärel inkubeeritakse membraani testitud antigeeni vastaste polüklonaalsete või monoklonaalsete antikehade lahuses. Pärast seondumata antikehade mahapesemist inkubeeritakse membraani sekundaarsete antikehade lahuses, mis on leeliselise fosfataasi ensüümide (leeliseline fosfataas, AP) või mädarõika peroksidaasi (HRP) konjugaat liigivastaste antikehadega (kitse antikehad küüliku, hiire või hiire vastu). inimese immunoglobuliinid) või valgud A (Staphylococcus aureus valk) või G (Streptococcus sp. valk), millel on kõrge afiinsus immunoglobuliinide Fc piirkonna suhtes.

Moodustunud immuunkomplekside tuvastamine toimub keemilise või kemoluminestsentsmeetodiga. Aluselise fosfataasi konjugaatide kasutamisel keemilise reaktsiooni substraadid on 5-bromo-4-kloro-3-indolüülfosfaat (BCIP) või tetrasooliumsinine (NBT) ning mädarõika peroksidaasi konjugaatide kasutamisel - 4-kloro-1-naftool ja vesinikperoksiid.

Ensümaatiliste reaktsioonide tulemusena moodustub membraanile antigeen-antikeha kompleksi lokaliseerimise kohas värviline riba või laik.

Selle meetodi tundlikkus on AP konjugaatide kasutamisel 100 pg valku ja HRP konjugaate kasutades 100-500 pg. Immuunkomplekside kemiluminestseeruv tuvastamine võimaldab tuvastada vähem kui 5 pg antigeeni. Selle meetodi põhimõte seisneb selles, et kui HRP reageerib vesinikperoksiidi ja tsüklilise diatsüülhüdrasiinluminooliga, kiirgatakse valgust lainepikkusel 428 nm, mida saab salvestada valgustundlikule filmile.

Immunoblot-reaktsioon (RI) töötati välja ELISA põhjal. See on kõige spetsiifilisem ja tundlikum immunokeemilise analüüsi meetod. Immunoblotanalüüs (inglise keelest blot - saada märjaks, spot) ühendab ELISA ja elektroforeesi. Seda kasutatakse mitte HIV-vastaste komplekssete antikehade, vaid selle üksikute struktuurvalkude (valgud-p24, glükoproteiinid-gp120, gp41 jne) tuvastamiseks. HIV-nakkuse diagnoosimiseks vaadake ekspertide (kinnitavaid) reaktsioone.

Reaktsioon viiakse läbi mitmes etapis:

Viirus hävitatakse komponentideks - antigeenideks (p24, gp120, gp 41 jne), mis allutatakse elektroforeesile polüakrüülamiidgeelis, see tähendab antigeenide eraldamist fraktsioonideks molekulmassi järgi.

2. Geel kaetakse nitrotselluloosmembraaniga ja antigeenifraktsioonid kantakse sellele elektroforeesi abil. Nitrotselluloos käitub nagu kuivatuspaber. Membraan lõigatakse ribadeks (ribadeks). Ettevõtted toodavad selliseid ribasid antigeenide "blotidega".

Immunoblotanalüüs - täiendav kaudne meetod

Sellele kantud HIV-antigeenidega ribad kastetakse katsealuse seerumis ja seejärel pestakse seondumata materjalist.

4. Ribasid inkubeeritakse peroksidaasiga märgistatud antiglobuliini seerumiga ja pestakse.

Lisatakse substraat ja märgitakse värviliste fraktsioonide (laikude) arv, mis vastavad AG-AT kompleksi lokaliseerimise tsoonile.

Triipude olemasolu riba teatud piirkondades kinnitab rangelt määratletud HIV-antigeenide vastaste antikehade olemasolu uuritud seerumis. Immunoblotanalüüsi tulemus loetakse positiivseks, kui membraanil on nähtavad triibud, mis vastavad mis tahes kahele kolmest HIV antigeenist - p24, gp41 ja gp 120 (joonis 37).

JOONISED

KASUTATUD KIRJANDUSE LOETELU

Peamine kirjandus

Meditsiiniline mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia: õpik arstitudengitele. ülikoolid 2. väljaanne, parandatud. ja täiendav — 702 lk. Ed. A.A. Vorobjov. M.: MIA, 2012.

2. Mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia: laboriuuringute juhend: õppejuhend / (V.B. Sboychakov et al.); toim. V.B.Sboychakova, M.M.Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 lk.: ill.

3. Meditsiiniline mikrobioloogia, immunoloogia ja viroloogia [Elektrooniline ressurss]: mee õpik.

ülikoolid - 760 p. — Juurdepääsurežiim: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Peterburi: Spetslit, 2010.

4. Meditsiiniline mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia [Elektrooniline allikas]: õpik: 2 köites / V. 1. - 448 lk. — Juurdepääsurežiim: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M. : Geotar Media, 2010. .

5. Meditsiiniline mikrobioloogia, viroloogia ja immunoloogia [Elektrooniline allikas]: õpik: 2 köites Vol. 2. - 480 lk. Juurdepääsurežiim: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M. : Geotar Media, 2010.

lisakirjandust

1. Immunodiagnostilised reaktsioonid: õpetus/ koostanud: G.K.Davletšina, Z.G.Gabidullin, A.A.Ahtarijeva, M.M.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Venemaa tervishoiuministeeriumi GBOU VPO BSMU kirjastus, 2016. - 86lk.

2. Mõnede omaduste tunnused, mis määravad Enterobacter, Сitrobacter, Serratia, E. coli, Proteus bakterite kaaskultiveeritud variatsioonide patogeense potentsiaali: teaduslik väljaanne / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.

Avaleht » Immunoblot – mis see on? Immunoblot diagnostikas nakkushaigused

Immunoblot - mis see on? Immunoblot nakkushaiguste diagnoosimisel

Mis on immunoblot? See on levinud meetod inimese viirusnakkuste laboratoorseks diagnoosimiseks. See on üks täpsemaid ja usaldusväärsemaid viise HIV-nakkuse tuvastamiseks.

Usaldusväärsuse huvides on see isegi suurem kui ensüümiga seotud immunosorbent (elisa) test. Immunobloti tulemusi peetakse lõplikuks ja veenvaks.Üldteave

Immunoblot - mis see on? Inimese HIV-positiivseks tunnistamiseks peate läbima laboriuuringu, et määrata antikehade olemasolu vereseerumis.

Western blot lõikude meetodit nimetatakse ka Western blot'iks (western blot). Seda kasutatakse täiendava ekspertmeetodina inimese viirusnakkuste tuvastamiseks. See on vajalik ELISA kinnitamiseks - laborianalüüs, mis võimaldab teil määrata HIV-i antikehade olemasolu veres. Immunoblot kontrollige uuesti positiivset ELISA-d.

Seda peetakse kõige tundlikumaks, keerukamaks ja kallimaks.

Sihtmärk

Mis on immunoblot? See tehnika laboriuuringud vereseerumi viirusevastaste antikehade olemasolu tuvastamiseks.

Geeli ja nitrotselluloosmembraanide viiruse üldvalkude eriuuringute käigus.

Immunoblotanalüüs (antikehade tuvastamine patsientide seerumis teatud patogeeni antigeenide suhtes)

Western blot sektsiooni protseduur on ette nähtud HIV-nakkuse määramiseks erinevates etappides. Esimeses etapis allutatakse selle koostisosadest puhastatud viirusele elektroforees ja selles sisalduvad antigeenid jagatakse molekulmassiga.

Inimese immuunpuudulikkuse viirus replitseerub elusrakkudes, mis on sisestatud tema geneetilisse teabesse. Selles etapis saab inimene HI-viiruse kandjaks, kui olete nakatunud.

Selle haiguse eripära on see, et see ei avaldu pikka aega. Viirus hävitab lümfotsüüte, mistõttu inimese immuunsus langeb ja organism ei suuda infektsioonidega võidelda.

Kui HIV-i ravitakse õigesti ja õigeaegselt, elab patsient küpse vanaduseni. Ravi puudumine viib paratamatult surmani. Alates nakatumise hetkest, kuid ilma ravita, ei ole maksimaalne periood üle kümne aasta.

Iseärasused

Immunoblotanalüüs on usaldusväärne meetod, mis võimaldab teil määrata esimest ja teist tüüpi HIV-antigeenide vastaste antikehade olemasolu.

Kui inimene on nakatunud, siis pärast kahenädalast antikehade tekkimist, mida saab tuvastada palju hiljem. HIV-i eripäraks on see, et antikehade hulk suureneb kiiresti ja jääb patsiendi verre. Isegi kui need on olemas, ei pruugi haigus avalduda kahe või enama aasta jooksul. ELISA meetod ei näita alati täpselt haiguse esinemist, mistõttu on vaja kinnitada PCR-i ja Western blot sektsioonide tulemused, kui ensüümi immuunanalüüs näitas positiivset tulemust.

Näidustused

Milline “immunoblot” on juba välja selgitatud, kuid mida uuringus tutvustatakse?

Inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV) immunobloti testimise põhjus on positiivne tulemus ELISA. Patsientidel, kellel on ees operatsioon, on vaja läbida ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs. Lisaks peaksite analüüsima naisi, kes plaanivad rasedust, samuti neid, kes on lootusetud. Kui elisa tulemused on küsitavad, antakse HIV-nakkusega patsientidele Western blot lõigud.

Arsti juurde pöördumise põhjuseks võivad olla järgmised murettekitavad sümptomid: kiire kaalulangus, nõrkus, funktsioonide kaotus, kolm nädalat kestev soolehäired (kõhulahtisus), vedelikupuudus, palavik, lümfisõlmede suurenemine kehas, kandidoosi, tuberkuloosi areng, kopsupõletik, toksoplasmoos, herpese ägenemine.

Patsient ei pea enne veenivere loovutamist valmistuma.

Ärge sööge 8-10 tundi enne analüüsi. Ei ole soovitatav päev enne vereloovutamist juua alkoholi ja kohvijooke, raske harjutus põnevust kogeda.

Kus analüüsi teha?

Kus saab HIV-testi teha?

Linna erakliinikutes läbiviidav immunoblotanalüüs ELISA annab tulemuse ühe päevaga. Võimalik on ka kohene diagnoos. avalikes asutustes, meditsiinilised testid elisa ja Western blot osa tasuta, vastavalt Vene Föderatsiooni õigusaktidele.

Rasedate naiste ning haiglaravi või operatsiooni vajavate patsientide nakkushaiguste kohustuslik sõeluuring Kuidas seda uuringut läbi viiakse?

Kuidas ELISA-d läbi viia? Immunoblot positiivne/negatiivne kinnitab või lükkab ümber elisa tulemused. Protseduur on üsna lihtne. Spetsialist võtab venoosset verd, ajaliselt kulub alla viie minuti.

Pärast proovi võtmist tuleb süstekoht desinfitseerida ja sulgeda plaastriga. Proovide võtmine toimub tühja kõhuga, nii et pärast protseduuri ei tee paha süüa tahvel tumedat šokolaadi või magusat kuuma jooki.

Tasuta analüüsi saatekirja saamiseks riiklikku raviasutusse tuleb külastada terapeudi.

Üldiselt ei erine immunoblot teistest proovide võtmisega tehtud vereanalüüsidest. Uurimismetoodika on lihtne. Kui viirus on inimese veres, hakkab organism selle hävitamiseks tootma antikehi. Iga viiruse jaoks on palju valgu antigeene. Nende antikehade tuvastamine on Western blot jaotusmeetodi aluseks. Hind

Kui palju analüüsi? Immunoblot HIV viitab odavatele uuringutele.

Keskmiselt on sõelumise immuunanalüüsi meetodid vahemikus 500 kuni 900 rubla. Western blot sektsioonid on uuringukontroll, mille maksumus on vahemikus kolm kuni viis tuhat rubla. Keerulisemad meetodid on palju kallimad. Näiteks polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) analüüsi eest peate maksma umbes 12 000 rubla.

Tulemuste tõlgendamine

Kõige tavalisemad HIV-nakkuse diagnoosimise meetodid on ensüümi immunoanalüüs ja immunoblot.

Need on ette nähtud inimese immuunpuudulikkuse viiruse vastaste seerumi antikehade määramiseks. Nakatumist kinnitavad tavaliselt kaks testi: sõeluuring ja kinnitav. Tulemuste tõlgendamise peaks tegema arst, ta paneb diagnoosi ja määrab ravi. Kui immunoblot on positiivne, tähendab see seda Inimkeha viirus.

Positiivne tulemus ei tohiks olla eneseravi põhjuseks, kuna igal patsiendil võib olla haigusest oma pilt.

Kvalitatiivne analüüs hõlmab sõeluuringut ja sertifitseerimist. Kui patsiendil viirust ei ole, on tulemus "negatiivne". Kui see sertifikaat leitakse, viiakse läbi täiendavad sõeluuringud. Immunoblotanalüüs, mis kinnitab või lükkab ümber sõeluuringu. Kui testribad ilmuvad teatud piirkondade tumenemisel (valgu lokaliseerimine), on diagnoos "HIV".

Kui tulemused on kahtlased, tehakse testid kolme kuu jooksul.

Inimese immuunpuudulikkuse viirusega nakatumise vältimiseks on see võimalik, kui järgite teatud reegleid: vältige juhuslikku seksuaalset kontakti, kasutage kontakti ajal kondoome, ärge kasutage ravimeid.

Kui haigus avastatakse rasedal naisel, on oluline järgida raviarsti soovitusi, ärge unustage viiruse esinemise teste.

Mis on Western Blotting?

Valkude tuvastamine mitmesuguste kudede keerukates segudes või ekstraktides on üks sageli esinevaid probleeme. Kasutades sellist tööriista spetsiifiliste antikehadena, on võimalik määrata uuritav valk minimaalse aja- ja rahakuluga.

Western blot meetodi puhul eraldatakse valkude segu esimeses etapis naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) juuresolekul elektroforeesiga, seejärel kantakse elektroblotanalüüsiga nitrotselluloosmembraanile.

Selle meetodi olemus seisneb selles, et geel pärast elektroforeesi asetatakse filterpaberi kihtide vahele nitrotselluloosmembraanile. Sel viisil kokkupandud "võileib" asetatakse elektrivälja, nii et valgu-SDS kompleksid liiguvad üle geelplaadi ja immobiliseeritakse (mittespetsiifilise sorptsiooni tulemusena) nitrotselluloosmembraani pinnale.

Valk-SDS kompleksi seondumisel nitrotselluloosmembraaniga osalevad peamiselt elektrilised jõud ning see interaktsioon on mitmepunktiline ja viib valkude "levitamiseni" membraani pinnal. Seega saame pärast elektriülekannet geeli koopia nitrotselluloosil, mille valgud on paigutatud samamoodi nagu polüakrüülamiidgeelis.

Pärast SDS - elektroforeesi, elektrotransfer ja valkude sorptsiooni geelist nitrotselluloosmembraanile läbiviimist muutub valgu tertsiaarne konformatsioon oluliselt, kui üldiselt on õige rääkida valgu tertsiaarse struktuuri olemasolust pärast sellist karm kohtlemine. Seetõttu kasutatakse uuritava valgu immunokeemiliseks tuvastamiseks tavaliselt ainult valgu molekuli lineaarsetele piirkondadele spetsiifilisi mono- või polüklonaalseid antikehi.

51. Ensüümide immunoanalüüs, immunoblotanalüüs. Mehhanism, komponendid, rakendus.

Konformatsiooniliste epitoopide (või alaühikutevahelisi kontakte hõlmavate saitide) suhtes spetsiifilised antikehad ei sobi üldiselt Western blot meetodi kasutamiseks.

Pärast valgu ülekandmist inkubeeritakse membraani järjestikku uuritava valgu suhtes spetsiifiliste antikehadega ja seejärel primaarsete antikehade Fc-fragmentide suhtes spetsiifiliste sekundaarsete antikehadega, mis on konjugeeritud ensüümi (või mõne muu) märgisega (joonis fig.

1 A). Juhul, kui uuritava antigeeni suhtes spetsiifilised primaarsed antikehad on otseselt konjugeeritud märgisega, ei ole sekundaarsed antikehad vajalikud (joonis 1 B). Uuritud valgu lokaliseerimise kohas moodustunud immuunkompleksid "avaldatakse" kromogeense substraadi abil (olenevalt märgistuse tüübist).

Meetodi tundlikkus ja spetsiifilisus sõltuvad suuresti sellest, milliseid antikehi uuringus kasutatakse.

Kasutatavad antikehad peavad olema spetsiifilised ainulaadse aminohappejärjestuse suhtes, mis on spetsiifiline ainult uuritava valgu suhtes. Vastasel juhul on võimalik antikehade interaktsioon (eriti jämedavalgu ekstraktide puhul) mitme valgu molekuliga, mis omakorda toob kaasa mitmete värviliste ribade ilmumise membraanile.

Sel juhul on uuritava valgu tuvastamine sageli keeruline või isegi võimatu.

Teine oluline tegur, mida antikehade valimisel silmas pidada, on afiinsus. Mida suurem on kasutatavate antikehade afiinsus, mida heledamalt ja selgemalt valguribad värvuvad, seda suurem on meetodi tundlikkus. Kõrge afiinsusega antikehade kasutamisel on võimalik saavutada tundlikkus 1 ng ja isegi suurem.

Membraaniga seotud antigeeni ja antikehade interaktsiooni tulemuse visualiseerimiseks kasutatakse sekundaarseid antikehi, mis on konjugeeritud ainetega, mis on võimelised teatud tingimustel teatud signaali andma.

Tavaliselt kasutatakse sellise ainena ensüümi (peroksüdaasi või fosfataasi), mille reaktsiooniprodukt on värvunud ja sadestub membraanile lahustumatu sademena.

ka sisse seda meetodit võib kasutada fluorestseeruvaid märgiseid.

Riis. 1. Uuritava valgu immunokeemilise värvimise skeem: A - ensüümmärgisega konjugeeritud sekundaarsete antikehade kasutamine; B - primaarne antikeha on otseselt konjugeeritud ensüümi märgisega.

Protokoll:

I. Geeli ja membraani valmistamine ning valgu elektrotransfer

Polüakrüülamiidgeel pandi pärast elektroforeesi vanni koos blotpuhvriga (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glütsiin, 10% etanool).

Kaks lehte filterpaberit, mis on lõigatud bloteerimiskasseti kuju järgi ja niisutatud bloteerimispuhvriga, asetatakse kasseti anoodi poole jäävale osale. Seejärel asetatakse filterpaberile sama puhvriga eelnevalt niisutatud nitrotselluloosmembraan, jälgides, et membraani ja paberi vahele ei jääks õhumulle.

Pärast seda tuleb geel ettevaatlikult membraanile asetada, uuesti keerates Erilist tähelepanuõhumullide puudumiseks geeli ja membraani vahel. Võileiva lõpetab kaks kihti niisutatud filterpaberit, mis asetatakse geeli pinnale (joonis 2). Saadud võileib kinnitatakse klambriga kassetti ja asetatakse elektroodide vahele nii, et membraan on anoodi poole.

Riis. 2. Valkude elektriülekande skeem membraanile.

II. elektriülekanne

Valkude elektroülekanne nitrotselluloosmembraanile viiakse läbi puhvris, mis sisaldab 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glütsiini, 10% etanooli 30–50 minuti jooksul konstantsel pingel 100 V.

Elektrotransfer aeg sõltub ülekantavate valkude suurusest, mida suurem on valk, seda kauem võtab elektriülekanne aega. Elektrotranspordi kvaliteeti ja valguribade paigutust hinnatakse nitrotselluloosmembraani värvimisega Ponceau S 0,3% lahusega 1% lahuses. äädikhape. Enne immunokeemilist värvimist tuleb membraani mitu korda pesta kergelt leeliselise Tris-i vesilahusega, et eemaldada valkudega seotud värvaine.

III. Nitrotselluloosmembraanile immobiliseeritud valkude immunokeemiline värvimine

Mittespetsiifiliste antikehade seondumiskohtade blokeerimiseks inkubeeritakse membraani pidevalt segades toatemperatuuril 30 minutit PBST-s (parema blokeerimise jaoks võib kasutada 10% lõssipulbrit sisaldavat PBST lahust).

Pärast blokeerimist inkubeeritakse membraani üks tund toatemperatuuril pidevalt segades PBST-s, mis sisaldab 1-10 μg/ml spetsiifilisi antikehi.

Antikehade optimaalne kontsentratsioon valitakse empiiriliselt ja see sõltub antikehade interaktsiooni afiinsusest antigeeniga.

Inkubeerimise lõpus pesti membraani 5 korda PBST-ga ja viidi üle mädarõika peroksüdaasiga konjugeeritud sekundaarsete antikehade lahusesse. Konjugaadi lahjenduse märgib tavaliselt pakendil tootja või valib selle empiiriliselt uurija. Inkubeerige membraani sekundaarsete antikehade lahuses 1 tund pidevalt segades.

Pärast põhjalikku pesemist (vähemalt 5-6 puhvri vahetust) viiakse PBST membraan kromogeensesse substraadi lahusesse, mis sisaldab 3 mg diaminobensidiini (DAB) ja 10 µl 30% vesinikperoksiidi 10 ml 0,1 M Tris-HCl-s, pH 7,6. .

Inkubeerimine viiakse läbi segades 5 kuni 10 minutit. Pärast substraadiga inkubeerimise lõppu tuleb membraani pesta PBST-ga, kuivatada filterpaberiga blottinguga ja teha koheselt värvilise skaneerimisega elektrooniline koopia. Kui membraan kuivab täielikult, tuhmuvad värvitud valgutriibud ning pilt on vähem hele ja kontrastne.

Märkus: DAB on mürgine ja potentsiaalne kantserogeen. Töötage ainult kummikinnastega!