Blot imun este pozitiv. Imunoblotting HIV pozitiv

Imunblotting (immunoblot, Western Blot, Western blot)- combină testul imunosorbent legat de enzime (ELISA) cu transferul electroforetic preliminar al antigenelor virale pe o bandă (bandă) de nitroceluloză.

În acest frumos nume științific, „blot” se traduce cel mai probabil prin „blot”, iar „western” prin „western” reflectă direcția de distribuție a acestui „blot” pe hârtie de la stânga la dreapta, adică pe o hartă geografică, aceasta corespunde direcției de la vest la est.” Esența metodei „blot imun” este că reacția imunoenzimatică se realizează nu cu un amestec de antigene, ci cu antigene HIV, distribuite anterior prin imunoforeză în fracții situate în funcție de greutatea moleculară pe suprafața unei membrane de nitroceluloză. Ca urmare, principalele proteine ale HIV, purtători de determinanți antigenici, sunt distribuite pe suprafață sub formă de benzi separate, care apar în timpul imunotestului enzimatic.

Imunoblot include mai multe etape:

Pregătirea benzii. Virusul imunodeficienței (HIV), care a fost anterior purificat și distrus în componentele sale constitutive, este supus electroforezei, în timp ce antigenele care alcătuiesc HIV sunt separați prin greutate moleculară. Apoi, prin blotting (analog cu stoarcerea excesului de cerneală pe un „blotter”), antigenele sunt transferate pe o bandă de nitroceluloză, care conține acum un spectru de benzi antigenice caracteristice HIV, invizibile pentru ochi.

Exemplu de studiu. Materialul de testat (ser, plasma sanguină a pacientului etc.) se aplică pe banda de nitroceluloză, iar dacă există anticorpi specifici în probă, aceștia se leagă de benzile antigenice strict corespunzătoare (complementare). Ca urmare a manipulărilor ulterioare, rezultatul acestei interacțiuni este vizualizat - făcut vizibil.

Interpretarea rezultatului. Prezența benzilor în anumite zone ale plăcii de nitroceluloză confirmă prezența în serul studiat a anticorpilor la antigenele HIV strict definite.

Banda A - Control pozitiv

Banda B - Control pozitiv slab

Banda C - Control negativ

Bandă D - Probă pozitivă (anticorpi la HIV-1 detectați)

În prezent, imunblotting (immunoblot) este principala metodă de confirmare a prezenței anticorpilor specifici virusului în serul de testat. În unele cazuri de infecție cu HIV, înainte de dezvoltarea seroconversiei, anticorpii specifici sunt detectați mai eficient prin metoda blotting imun decât ELISA. Un studiu de blotting imun a arătat că anticorpii la gp 41 sunt cel mai adesea detectați în serul pacienților cu SIDA, iar detectarea p24 la persoanele examinate în scop profilactic necesită studii suplimentare pentru prezența infecției cu HIV. Sistemele de testare imunoblot bazate pe proteine recombinante modificate genetic s-au dovedit a fi mai specifice decât sistemele convenționale bazate pe lizat de virus purificat. Atunci când se utilizează un antigen recombinant, nu se formează o bandă de antigen difuză, ci o bandă îngustă clar definită, care este ușor accesibilă pentru contabilizare și evaluare.

Serul persoanelor infectate cu HIV-1 detectează anticorpi la următoarele proteine majore și glicoproteine - proteine structurale ale anvelopei (env) - gp160, gp120, gp41; nuclee (gag) - p17, p24, p55, precum și enzime virale (pol) - p31, p51, p66. Pentru HIV-2, anticorpii la env sunt tipici - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol-p68.

Dintre metodele de laborator necesare pentru a stabili specificitatea reacției, cea mai mare recunoaștere are cea mai mare recunoaștere detectarea anticorpilor la proteinele anvelopei HIV-1 - gp41, gp120, gp160 și HIV-2 - gp36, gp105, gp140.

OMS consideră serul pozitiv dacă anticorpii la oricare două glicoproteine HIV sunt detectați prin imunoblot. Conform acestor recomandări, dacă există o reacție doar cu una dintre proteinele învelișului (rp 160, rp 120, rp 41) în combinație sau fără reacție cu alte proteine, rezultatul este considerat îndoielnic și se recomandă un al doilea test folosind un kit dintr-o altă serie sau de la o altă firmă. Dacă după aceasta rezultatul rămâne îndoielnic, se recomandă observarea timp de 6 luni (cercetare după 3 luni).

Prezența unei reacții pozitive cu antigenul p24 poate indica o perioadă de seroconversie, deoarece anticorpii la această proteină apar uneori primii. În acest caz, se recomandă, în funcție de datele clinice și epidemiologice, să se repete studiul cu o probă de ser prelevată cel puțin 2 săptămâni mai târziu, și exact așa este atunci când în infecția HIV sunt necesare seruri pereche.

Reacțiile pozitive cu proteinele gag și pol fără prezența unei reacții cu proteinele env pot reflecta stadiul de seroconversie timpurie și pot indica, de asemenea, infecția cu HIV-2 sau o reacție nespecifică. Persoanele cu astfel de rezultate după testarea HIV-2 sunt reexaminate după 3 luni (în decurs de 6 luni).

Imunoblot include mai multe etape:

Interpretarea rezultatului. Prezența benzilor în anumite zone ale plăcii de nitroceluloză confirmă prezența în serul studiat a anticorpilor la antigenele HIV strict definite.

Banda A - Control pozitiv

Banda B - Control pozitiv slab

Banda C - Control negativ

Bandă D - Probă pozitivă (anticorpi la HIV-1 detectați)

În prezent, imunblotting (immunoblot) este principala metodă de confirmare a prezenței anticorpilor specifici virusului în serul de testat. În unele cazuri de infecție cu HIV, înainte de seroconversie, anticorpii specifici sunt detectați mai eficient prin imunoblot decât prin ELISA. Un studiu de blotting imun a arătat că anticorpii la gp 41 sunt cel mai adesea detectați în serul pacienților cu SIDA, iar detectarea p24 la persoanele examinate în scop profilactic necesită studii suplimentare pentru prezența infecției cu HIV. Sistemele de testare imunoblot bazate pe proteine recombinante modificate genetic s-au dovedit a fi mai specifice decât sistemele convenționale bazate pe lizat de virus purificat. Atunci când se utilizează un antigen recombinant, nu se formează o bandă de antigen difuză, ci o bandă îngustă clar definită, care este ușor accesibilă pentru contabilizare și evaluare.

Ce este - imunblot? Aceasta este o metodă comună diagnostic de laborator infecții virale persoană. Este considerată una dintre cele mai precise și fiabile modalități de a detecta prezența HIV. În fiabilitatea sa, depășește chiar și rezultatele imunoblot sunt considerate irefutabile și definitive.

informatii generale

Imunoblot - ce este? Pentru a recunoaște o infecție cu HIV la o persoană, este necesar să se efectueze un test de laborator al serului sanguin pentru prezența anticorpilor. Tehnica Western blot se mai numește și Western blot. Este folosit pentru a detecta infecțiile virale umane ca metodă suplimentară expertă. Este necesar să confirmați ELISA - un test de laborator care vă permite să determinați prezența anticorpilor HIV în sânge. O analiză ELISA pozitivă este reverificată prin imunoblot. Este considerat cel mai sensibil, complex și costisitor.

scop

Ce este - imunblot? Aceasta este o tehnică de testare de laborator a serului sanguin pentru prezența anticorpilor împotriva virusului. În timpul studiului, specialistul pre-separă proteinele virusului din gel și le transferă pe o membrană de nitroceluloză. Procedura de imunoblotare are scopul de a determina HIV pentru diferite etape. În prima etapă, virusul purificat din părțile sale constitutive este supus electroforezei, iar antigenele care alcătuiesc compoziția sa sunt separați în funcție de greutatea moleculară.

Se reproduce într-o celulă vie, înglobând informațiile sale genetice în ea. În această etapă, o persoană devine purtătoare a virusului HIV dacă a fost infectată. Specificul bolii este că s-ar putea să nu se manifeste mult timp. Virusul distruge limfocitele, astfel încât imunitatea umană este redusă, iar organismul devine incapabil să reziste infecțiilor. Dacă HIV este tratat în mod competent și la timp, pacientul va trăi până la o vârstă înaintată. Lipsa terapiei duce inevitabil la moarte. Din momentul infectării, dar fără tratament, durata maximă de viață nu este mai mare de zece ani.

Particularități

Analiza imunoblot este o metodă fiabilă care vă permite să determinați prezența anticorpilor la antigenele HIV de primul și al doilea tip. Dacă o persoană este infectată, în două săptămâni apar anticorpii, care pot fi detectați mult mai târziu. Particularitatea HIV este că numărul de anticorpi crește rapid și rămâne în sângele pacientului. Chiar dacă sunt prezente, boala poate să nu se manifeste timp de doi sau mai mulți ani. Metoda ELISA nu determină întotdeauna cu exactitate prezența bolii, prin urmare, este necesară confirmarea rezultatelor prin imunoblotting și PCR dacă imunotestul enzimatic este pozitiv.

Indicații pentru programare

Ce este acest „imunoblot” a fost deja descoperit, dar cine este prescris acest studiu? Motivul pentru a face teste pentru metoda de imunoblot este un rezultat ELISA pozitiv. Este necesar să se treacă prin imunotest enzimatic pentru pacienții care vor fi operați. În plus, ar trebui făcută o analiză pentru femeile care planifică o sarcină, precum și pentru toți cei care sunt promiscui. viata sexuala. Atribuiți imunoblotting pacienților cu HIV, dacă rezultatele ELISA sunt îndoielnice. Următoarele simptome alarmante pot fi motivul pentru care mergeți la medic:

pierdere bruscă în greutate;
slăbiciune, pierderea capacității de lucru;
tulburare intestinală (diaree) care durează trei săptămâni;
deshidratarea organismului;
febră;
crește noduli limfatici pe corp;
dezvoltarea candidozei, tuberculozei, pneumoniei, toxoplasmozei, exacerbarea herpesului.

Pacientul nu trebuie să se pregătească înainte de a dona sânge venos. Cu 8-10 ore înainte de studiu, nu puteți mânca. Nu este recomandat să bei băuturi alcoolice și de cafea, să te angajezi în exerciții fizice grele, să experimentezi emoție cu o zi înainte de donarea de sânge.

Unde se face analiza?

Unde pot fi testat pentru HIV? Studiile ELISA, imunoblot sunt efectuate în clinici private urbane, rezultatele sunt eliberate într-o zi. Diagnosticul imediat este, de asemenea, posibil. În instituțiile medicale de stat, testele ELISA și imunoblotting sunt efectuate gratuit, în conformitate cu legislația Federației Ruse. Femeile însărcinate, precum și pacienții care urmează să fie internați sau supuși unei intervenții chirurgicale, trebuie să fie testați pentru boli infecțioase.

Cum se face cercetarea?

Cum se efectuează ELISA? Imunoblot pozitiv/negativ confirmă sau infirmă rezultatele imunotestului enzimatic. Procedura de cercetare este destul de simplă. Specialistul efectuează o prelevare de sânge venos, în timp nu durează mai mult de cinci minute. După prelevare, locul de injectare trebuie dezinfectat și sigilat cu un ipsos. Eșantionarea se efectuează pe stomacul gol, așa că după procedură nu strica să mănânci un baton de ciocolată neagră sau să bei o băutură caldă dulce.

Pentru a obține o recomandare pentru o analiză gratuită în stat institutie medicala trebuie să vizitați un medic generalist. În general, imunoblotul nu diferă de alte analize de sânge în ceea ce privește metoda de prelevare. Metodologia cercetării este simplă. Dacă un virus este prezent în sângele unei persoane, organismul începe să producă anticorpi pentru a-l distruge. Fiecare virus are propriul său set de proteine antigene. Detectarea acestor anticorpi este baza tehnicii Western blotting.

Preț

Cât costă analiza? Imunoblot pentru HIV nu se aplică cercetării ieftine. În medie, o examinare de screening prin imunotest enzimatic costă între 500 și 900 de ruble. Imunoblotting este un studiu de verificare, al cărui cost este de la trei la cinci mii de ruble. Metodele mai complexe sunt mult mai scumpe. De exemplu, va trebui să plătiți aproximativ 12.000 de ruble pentru el.

Interpretarea rezultatului

Cele mai comune metode de diagnosticare a infecției cu HIV sunt imunotestul enzimatic și imunoblot. Ele sunt utilizate pentru determinarea anticorpilor serici împotriva virusului imunodeficienței. Prezența infecției este de obicei confirmată prin două teste: screening și confirmator. Interpretarea rezultatelor studiului ar trebui să fie efectuată de un medic, el pune, de asemenea, un diagnostic și prescrie tratament. Dacă imunoblotul este pozitiv, înseamnă că un virus este prezent în corpul uman.

Un rezultat pozitiv nu ar trebui să fie un motiv pentru auto-tratament, deoarece fiecare pacient poate avea propria sa imagine a bolii. Analiza calitativa include screening și verificare. Dacă pacientul nu are un virus, atunci rezultatul este indicat ca „negativ”. Atunci când este detectat prin metoda de screening, se efectuează un studiu suplimentar de verificare. Un imunblot este o analiză care confirmă sau infirmă o screening. Dacă pe banda de testare apare întunecare în anumite zone (locuri de localizare a proteinelor), se pune diagnosticul de HIV. Dacă rezultatele sunt îndoielnice, testele sunt efectuate în termen de trei luni.

Puteți preveni infectarea cu virusul imunodeficienței dacă respectați anumite reguli: evitați sexul ocazional, folosiți prezervativ în timpul contactelor, nu luați medicamente. Dacă boala este detectată la o femeie însărcinată, este important să urmați cu strictețe recomandările medicului curant, nu uitați să treceți la examinări pentru prezența virusului.

În practica diagnosticului de laborator al bolilor infecțioase, uneori este nevoie să se determine anticorpi nu pentru un agent patogen în general, ci pentru anumite proteine (antigeni) ale acestuia, adică un spectru de anticorpi specifici. Dacă în acest scop este utilizată metoda testului imunosorbent legat de enzime, atunci în acest caz este necesară izolarea și purificarea antigenelor necesare din cultura patogenului. Proteinele rezultate sunt aplicate separat fazei solide. În cazul utilizării unei plăci cu 96 de godeuri - în fiecare godeu, câte un tip de antigen. Anticorpii specifici sunt apoi determinați printr-o metodă indirectă.

Prin prezența unei reacții pozitive în godeu cu unul sau altul antigen, se poate aprecia prezența anticorpilor specifici corespunzători. Acest tip de sisteme de testare imunologică enzimatică sunt oferite de producători, cu toate acestea, datorită conținutului mai mare de informații și ușurinței de executare a studiului în sine, metoda imunoblotting (Western blot) a devenit larg răspândită.

Imun blotting face posibilă determinarea anticorpilor în serul sanguin simultan și în același timp diferențiat față de toate testele de diagnostic. proteine importante patogen. Traducerea din engleză Western blot înseamnă transfer occidental (literalmente - blot). Istoria acestui termen neobișnuit este următoarea.

Un om de știință pe nume Southern (E. Southern) a propus pentru prima dată în 1975 o metodă pentru transferul fragmentelor de ADN separate electroforetic dintr-un gel pe o membrană. Potrivit autorului, metoda a fost numită Southern blot, ceea ce înseamnă „transfer sudic”. Metoda de transfer a moleculelor de ARN, la rândul său, a fost supranumită Northern blot de către specialiști - „transfer nordic”. La început ca o glumă, iar apoi acest nume a fost fixat în literatura științifică oficială.

G. Toubin a publicat în 1979 rezultatele primelor experimente despre protein blotting. În continuarea tradițiilor denumirilor „geografice” ale metodelor de transfer de macromolecule biologice, această metodă a devenit cunoscută sub numele de transfer „Western” - Western blot.

În prima etapă a acestei metode, se efectuează separarea electroforetică a unui amestec de proteine patogene într-un gel de poliacrilamidă în prezență de dodecil sulfat de sodiu (SDS). SDS, fiind superficial substanta activa, învelește uniform moleculele de proteine și le conferă tuturor o sarcină negativă de mărime aproximativ egală. Prin urmare, moleculele se mișcă într-un câmp electric într-o direcție, iar viteza de mișcare depinde doar de dimensiunea moleculei (greutatea moleculară) a proteinei.

Ca urmare a procedurii electroforetice, se obține o placă de gel, în grosimea căreia proteinele sunt situate sub formă de zone liniare subțiri separate. În direcția de mișcare, acestea sunt împărțite în următoarea ordine: proteinele cu greutate moleculară mare, aproximativ 120-150 kDa, sunt mai aproape de început, iar proteinele cu o masă de 5-10 kDa au avansat mai departe până la linia de sosire. În a doua etapă, placa de gel este așezată pe o foaie de nitroceluloză și această structură este plasată între electrozii sursei DC. Sub acțiunea unui câmp electric, proteinele curg din gelul poros către o membrană mai densă, unde sunt fixate ferm.

Pata rezultată este tratată cu o soluție de blocare care conține proteine antigenic indiferente și/sau detergenți neionici (Tween 20), care blochează locurile fără antigen de pe membrană. Foaia de membrană este apoi tăiată în benzi înguste, astfel încât fiecare bandă să conțină toate fracțiile antigenice. Pașii descriși sunt efectuati de producător.

Sistemele comerciale de testare pentru detectarea anticorpilor prin blotting imun conțin pete (fâșii sau benzi) gata pentru analiză. Utilizatorul determină întregul spectru de anticorpi specifici la proteinele patogene conform schemei metodei indirecte. Ca cromogen pentru efectuarea unei reacții de culoare (enzimatică), se utilizează o substanță incoloră solubilă, al cărei produs capătă o culoare, devine insolubilă și se depune (precipită) pe nitroceluloză.

Ca rezultat al reacțiilor imune și enzimatice secvențiale, în prezența anticorpilor la proteinele patogene în proba de testat, pe pată apar dungi transversale întunecate, a căror locație se află în zona anumitor proteine patogene. Fiecare astfel de bandă indică prezența anticorpilor specifici la antigenul corespunzător. Rezultatul unui studiu efectuat prin metoda de blotting imun este emis sub forma unei liste de anticorpi la proteine specifice ale agentului patogen. De exemplu: „au fost detectați anticorpi la proteinele p17 și p24”.

Petele de nitroceluloză după dezvoltare pot fi păstrate mult timp sub formă uscată. Cu toate acestea, intensitatea culorii este slăbită semnificativ. Petele umede pot fi fotografiate sau, folosind scanere, imaginea lor grafică poate fi introdusă în memoria computerelor personale. Programele speciale de calculator vă permit să procesați rezultatele și să urmăriți rapid dinamica spectrului de anticorpi în timpul monitorizării dinamice

Imunoblotting -(din engleză „blot” - spot) - o metodă de identificare a antigenelor (sau a anticorpilor) folosind seruri (sau antigene) cunoscute. Este o combinație de electroforeză pe gel cu ELISA. Inițial, celulele bacteriene sau virionii sunt distruși cu ajutorul ultrasunetelor, iar apoi toți antigenii virusului sau celulele bacteriene sunt separați prin electroforeză și se obține un reactiv comercial pe o peliculă specială de nitroceluloză. La instalarea imunoblotării, serul de testare al pacientului este aplicat pe filmul cu antigeni cunoscuți. După incubarea și spălarea anticorpilor nelegați, aceștia trec la ELISA - un antiser pentru imunoglobulinele umane marcat cu o enzimă și un substrat cromogen care își schimbă culoarea atunci când interacționează cu enzima sunt aplicate pe film. În prezența complexelor antigen-anticorp-antiser la imunoglobulină-enzimă, pe purtător apar pete colorate. Metoda de imunoblot vă permite să detectați separat anticorpi la diferiți antigeni ai agentului patogen (de exemplu, în infecția cu HIV, imunoblotting detectează anticorpi la gp120, gp24 și alți antigeni ai virusului).

Radioimunotest (RIA)

Metoda se bazează pe reacția antigen-anticorp folosind un antigen sau un anticorp cu un radionuclid. 125I, 14C, 3H, 51Cr și alți radionuclizi sunt utilizați ca etichetă. Complexele imune rezultate sunt izolate din sistem și radioactivitatea lor este determinată pe contoare (radiație β). Intensitatea radiației este direct proporțională cu numărul de antigen și molecule de anticorpi legați.

Versiunea în fază solidă a RIA care utilizează anticorpi marcați sau antigeni adsorbiți în godeurile panourilor de polistiren este utilizată pe scară largă.

RIA este utilizat pentru detectarea antigenelor microbilor, virușilor, diverșilor hormoni, enzimelor, substanțelor medicinale, imunoglobulinelor, precum și a altor substanțe conținute în materialul de testat în concentrații minore de 10–12–10–15 g/l.

întrebări de testare

Reacția de bacterioliză imună: ce fel de reacție este; ce este un antigen, ce este un anticorp, mecanism de reacție, metode de stadializare, uz practic. Reacție de hemoliză imună: ingrediente necesare, metoda de fixare; controale, aplicare practică. Reacția de hemoliză locală în gel (reacția Yerne): principiul reacției, metoda de formulare, aplicarea practică. Reacția de fixare a complementului: principiu de reacție; ce se formează atunci când serul imunitar interacționează cu un antigen specific; ce se întâmplă cu complementul dacă este prezent în această interacțiune? Care este soarta complementului dacă nu există o afinitate specifică între antigen și anticorpi? Ce reacție poate fi folosită pentru a determina ce sa întâmplat cu complementul; de ce se folosește această reacție; care este rezultatul pozitiv vizibil al RSK? De ce? Ce proprietate a complementului este folosită în prima fază a CSC? In faza a doua? Dacă rezultatul final al RSK este hemoliza, înseamnă asta un rezultat pozitiv sau negativ? Explicați rezultatele: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Numiți ingredientele primului sistem RSK și ingredientele celui de-al doilea sistem RSK. De ce trebuie să fie inactivat serul de testare? Cum se titra complementul? Ser hemolitic: ce conține, cum se obține, ce este titrul și cum se determină? Ce animale sunt folosite pentru a obține componente RSC? Tehnica de setare a RSC la frig. Atunci când stadializați care dintre următoarele reacții, este necesară participarea unui complement: precipitare, floculare, aglutinare, detectarea anticorpilor incompleti, bacterioliză imună, hemoliză imună, Jerne, CSC? Reacția de imunofluorescență (RIF) - indică succesiunea evenimentelor din reacția directă Coons; ingredientele necesare. Ce este un antigen, ce este un anticorp, cum sunt marcați anticorpii, cum este luat în considerare rezultatul reacției, cum arată un rezultat pozitiv? Aplicație practică - ce se poate determina folosind această reacție? Reacție de imunofluorescență indirectă - indicați succesiunea evenimentelor din această reacție, ingredientele necesare, care este antigenul, ce seruri imune sunt utilizate; uz practic; avantajul RIF indirect față de reacția directă. Test imunosorbant legat(ELISA) - principiu de reacție; ingredientele necesare; indicați secvența evenimentelor la stabilirea unei reacții pentru a detecta un antigen în materialul de testat; ingredientele necesare; ce se întâmplă cu un rezultat pozitiv, cum arată? Specificați secvența acțiunilor în timpul ELISA pentru a detecta anticorpii în serul de testat; ingredientele necesare; ce se intampla cu un rezultat pozitiv? Imunoblotting - principiul reacției; pașii principali; ingredientele necesare; Cum se ia în calcul rezultatul? beneficii de reacție. Radioimunotest (RIA) - care sunt principalele etape ale reacției; cu ce sunt marcați anticorpii sau antigenele, cum se ia în considerare rezultatul? Microscopia imunoelectronică - principiul metodei; pașii principali; ingredientele necesare; Cu ce sunt marcați anticorpii? cum se ia în considerare rezultatul reacției. Reacții de imobilizare - principiul metodei, tehnica de setare, componente, contabilizarea rezultatelor.

Sarcini de îndeplinit în procesul de autoformare.

Completați tabelul Reacții de imunitate pentru reacțiile abordate în acest subiect.

Reacții imune

Lucrarea elevului într-o lecție practică

Începeți munca imediat cu formularea primei faze a RSC, dar notați-o într-un caiet mai târziu (vezi mai jos).

1. Reacția de hemoliză imună. Vizualizați o reacție demonstrativă a hemolizei imune, desenați-o sub formă de diagramă, explicați rezultatul în tuburile experimentale și de control.

2. Reacția de legare a complementului

a) dezasamblați RSC conform tabelului;

b) desenează într-un caiet o schemă de stabilire a RSC sub formă de tabel;

c) pune faza a doua a RSK (prima faza este pusa la inceputul lectiei);

d) dezasamblați preparatele de diagnostic necesare RSK;

e) ţine cont de rezultat. Formulați o concluzie despre prezența anticorpilor specifici în serul de testat.

3. Reacția de imunofluorescență. Studiați tabelul, întocmește o schemă de stabilire a reacției în caiet; vezi seruri de diagnostic; determinați ce conține serul, cum este preparat, pentru ce reacție (RIF directă sau indirectă) este utilizat. Uitați-vă la rezultatul demonstrației RIF într-un microscop fluorescent.

4. Imunotestul enzimatic (ELISA). În caiet, întocmește o schemă de reacție în două versiuni: pentru detectarea unui antigen în materialul de testat și pentru detectarea anticorpilor în ser. Examinați trusa de ingrediente pentru diagnosticul HIV și hepatitei B. Determinați ce conține fiecare ingredient și pentru ce este utilizat.

5. Imunoblotting. Faceți o diagramă a reacției în caiet; vezi demo - rezultatul reacției.

6. Radioimunotest (RIA). Desenați schema de reacție în caiet.

7. Microscopia electronică imunitară (IEM). Urmărește demonstrația - rezultatul reacției, întocmește o schemă de reacție în caiet, indica antigenul (virusul) și anticorpii etichetați cu săgeți.

Immunoblotting este o metodă de detectare a proteinelor extrem de sensibilă, bazată pe o combinație de electroforeză și ELISA sau RIA. Imunoblotting este utilizat ca metoda de diagnostic cu infecție HIV etc.

Într-un sens general, imunoblotarea este înțeleasă ca analiza unui amestec de proteine transferate pe o membrană suport solidă, cu care se leagă prin legături covalente, urmată de imunodetecție.

Este posibil să se analizeze un amestec de proteine depus direct pe un substrat (analiza dot blot) sau după fracţionarea lui preliminară prin electrofocalizare, electroforeză pe disc sau electroforeză bidimensională (Western blotting).

Antigenii patogeni sunt separați prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă, apoi transferați din gel pe hârtie activată sau membrana de nitroceluloză și dezvoltați prin ELISA.

Firmele produc astfel de benzi cu „bloturi” de antigene. Pe aceste benzi se aplică serul pacientului. . Apoi, după incubare, pacientul este spălat de anticorpii nelegați ai pacientului și se aplică ser împotriva imunoglobulinelor umane marcate cu enzima. . Complexul format pe bandă (antigen + anticorp al pacientului + anticorp împotriva Ig umană) este detectat prin adăugarea unui substrat cromogen care își schimbă culoarea sub acțiunea enzimei.

Această metodologie se aplică și selecției clonelor de bacterii, fagi sau viruși care exprimă produsele genelor țintă donate.

Transferul proteinelor pe membrană se realizează fie pasiv sau folosind un aparat de electrotransfer. Eficiența transferului de proteine către membrană este afectată de mulți factori, cum ar fi greutatea moleculară a proteinelor, porozitatea gelului, timpul de transfer și compoziția soluției tampon (tampon trans) utilizată.

În funcție de sarcinile și condițiile experimentului, sunt selectate condiții de transfer care oferă cele mai bune rezultate. Substraturile utilizate în mod obișnuit sunt nitroceluloza, difluorura de poliviniliden (PVDF) sau membranele de nailon încărcate pozitiv. Nitroceluloza poate lega până la 80-100 micrograme de proteine la 1 cm2.

Proteinele cu greutate moleculară mică (cu o greutate moleculară mai mică de 20 kDa) pot fi pierdute ca urmare a spălărilor, ceea ce face posibilă studierea preliminară a polimorfismului anumitor loci genetici prin lungimile fragmentelor de ADN de restricție corespunzătoare.

În plus, folosind hibridizarea Southern, este ușor să aflați dacă gena țintă are un loc de hidroliză de către o anumită enzimă de restricție în partea sa internă, ceea ce vă permite să alegeți strategia optimă pentru clonarea regiunii genomului studiat.

Conform unei scheme similare, moleculele de ARN pot fi, de asemenea, transferate din gel de agaroză la un filtru de nitroceluloză. Această metodă a fost numită Northern blot spre deosebire de Southern blot, deoarece numele de familie Southern in Limba englezăînseamnă „sudic”.

Transferul la filtre din gelul proteic a fost denumit în consecință Western blot. Proteinele mari (mai mare de 100 kDa) denaturate în soluție de dodecil sulfat de sodiu (SDS) pot fi transferate slab la membrană dacă etanolul este prezent în tamponul trans. Alcoolul îmbunătățește semnificativ transferul de proteine din gelul SDS-poliacrilamidă, dar îngustează porii din gel, ceea ce duce la reținerea proteinelor mari.

Membrana PVDF este optimizată pentru imunodetecție și este capabilă să rețină proteinele legate în mod specific până la 160 µg/cm2 cu un nivel foarte scăzut de legare nespecifică.

Imunoblotting

O proprietate importantă a acestei membrane este posibilitatea utilizării sale repetate. Membranele de nailon Zeta-Probe leagă eficient proteinele SDS în absența alcoolului, iar această legare este rezistentă la tratamentele ulterioare. Proteinele cu greutate moleculară mică sunt de asemenea reținute eficient. Cu o capacitate mare de legare de aproximativ 480 μg de proteină per 1 cm2, membranele Zeta-Probe permit detectarea urmelor de proteine în amestecurile de analiză.

După ce antigenul este imobilizat pe membrană, locurile de legare rămase sunt blocate cu soluții de gelatină, sau albumină serică bovină sau lapte degresat.

Apoi membrana este incubată într-o soluție de anticorpi policlonali sau monoclonali la antigenul testat. După spălarea anticorpilor nelegați, membrana este incubată într-o soluție de anticorpi secundari, care sunt un conjugat de enzime fosfatază alcalină (fosfatază alcalină, AP) sau peroxidază de hrean (HRP) cu anticorpi anti-specie (anticorpi de capră la iepure, șoarece sau imunoglobuline umane) sau proteine A (proteina Staphylococcus aureus) sau G (proteina Streptococcus sp.) având o afinitate mare pentru regiunea Fc a imunoglobulinelor.

Detectarea complexelor imune formate se realizează prin metoda chimică sau chimiluminiscentă. Substraturile pentru reacția chimică atunci când se folosesc conjugați de fosfatază alcalină sunt 5-bromo-4-clor-3-indolilfosfat (BCIP) sau albastru de tetrazoliu (NBT), iar când se utilizează conjugați de peroxidază de hrean - 4-clor-1-naftol și peroxid de hidrogen.

Ca rezultat al reacțiilor enzimatice, pe membrană se formează o bandă sau o pată colorată la locul de localizare a complexului antigen-anticorp.

Sensibilitatea acestei metode este de 100 pg de proteină atunci când se utilizează conjugate AP și 100-500 pg când se utilizează conjugate HRP. Detectarea chemiluminiscentă a complexelor imune poate detecta mai puțin de 5 pg de antigen. Principiul acestei metode este că atunci când HRP reacționează cu peroxid de hidrogen și diacilhidrazineluminol ciclic, se emite lumină la o lungime de undă de 428 nm, care poate fi înregistrată pe o peliculă fotosensibilă.

Reacția de imunoblot (RI) a fost dezvoltată pe baza ELISA. Este cea mai specifică și sensibilă metodă de analiză imunochimică. Immunoblotting (din engleză blot - a se uda, spot) combină ELISA cu electroforeza. Este folosit pentru a detecta nu anticorpi complecși la HIV, ci anticorpi la proteinele sale structurale individuale (proteine-p24, glicoproteine-gp120, gp 41 etc.). Consultați reacțiile experților (de confirmare) pentru diagnosticul infecției cu HIV.

Reacția se desfășoară în mai multe etape:

Virusul este distrus în componente - antigene (p24, gp120, gp 41 etc.), care sunt supuse electroforezei într-un gel de poliacrilamidă, adică separarea antigenilor în fracții după greutatea moleculară.

2. Gelul este acoperit cu o membrană de nitroceluloză și fracțiile de antigen sunt transferate în acesta prin electroforeză. Nitroceluloza se comportă ca hârtie absorbantă. Membrana este tăiată în benzi (fâșii). Firmele produc astfel de benzi cu „bloturi” de antigene.

Imunoblotting - o metodă indirectă suplimentară

Benzile cu antigeni HIV aplicați sunt scufundate în serul subiectului și apoi spălate din materialul nelegat.

4. Benzile se incubează cu ser antiglobulină marcat cu peroxidază și se spală.

Se adaugă un substrat și se notează numărul de fracții colorate (pete), care corespund zonei de localizare a complexului AG-AT.

Prezența dungilor în anumite zone ale benzii confirmă prezența în serul studiat a anticorpilor la antigenele HIV strict definite. Rezultatul imunoblotării este considerat pozitiv dacă benzile corespunzătoare oricărui doi dintre cei trei antigeni HIV - p24, gp41 și gp 120 sunt vizibile pe membrană (Fig. 37).

DESENE

LISTA LITERATURII UTILIZATE

Literatura principală

Microbiologie medicală, virologie și imunologie: un manual pentru studenții la medicină. universități ed. a II-a, corectată. si suplimentare — 702 p. Ed. A.A. Vorobyov. M. : MIA, 2012.

2. Microbiologie, virologie și imunologie: un ghid pentru studii de laborator: ghid de studiu / (V.B. Sboychakov și colab.); ed. V.B.Sboychakova, M.M.Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 p.: ill.

3. Microbiologie medicală, imunologie și virologie [Resursa electronică]: un manual pentru miere.

universități - 760 p. — Mod de acces: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Sankt Petersburg: Spetslit, 2010.

4. Microbiologie medicală, virologie și imunologie [Resursa electronică] : manual: în 2 volume / V. 1. - 448 p. — Mod de acces: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M. : Geotar Media, 2010. .

5. Microbiologie medicală, virologie și imunologie [Resursă electronică]: manual: în 2 volume.Vol. 2. - 480 p. Mod de acces: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M. : Geotar Media, 2010.

literatură suplimentară

1. Reacții de imunodiagnostic: tutorial/ compilat de: G.K. Davletshina, Z.G. Gabidullin, A.A. Akhtariyeva, M.M.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Editura GBOU VPO BSMU a Ministerului Sănătății al Rusiei, 2016. - 86p.

2. Caracteristicile unor proprietăți care determină potențialul patogen al variațiilor co-cultivate ale bacteriilor Enterobacter, Сitrobacter, Serratia, E. coli, Proteus: publicație științifică / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.

Acasă » Immunoblot - ce este? Imunoblot în diagnosticare boli infecțioase

Imunoblot - ce este? Imunoblot în diagnosticul bolilor infecțioase

Ce este un imunblot? Aceasta este o metodă comună pentru diagnosticul de laborator al infecțiilor virale umane. Este una dintre cele mai precise și fiabile modalități de a detecta prezența HIV.

Pentru fiabilitate, este chiar mai mare decât testul imunosorbent cuplat cu enzime (elisa). Rezultatele imunoblot sunt considerate concludente și concludente.Informații generale

Imunoblot - ce este? Pentru a recunoaște o persoană ca fiind HIV pozitivă, trebuie să fii supus unui test de laborator pentru a testa prezența anticorpilor în serul sanguin.

Metoda secțiunilor Western blot se mai numește și Western blot (western blot). Este folosit pentru a detecta infecțiile virale umane, ca metodă suplimentară expertă. Acest lucru este necesar pentru a confirma ELISA - un test de laborator care vă permite să determinați prezența anticorpilor împotriva HIV în sânge. Immunoblot reverificare ELISA pozitiv.

Este considerat cel mai sensibil, complex și costisitor.

Ţintă

Ce este un imunblot? Această tehnică cercetare de laborator ser de sânge pentru prezența anticorpilor împotriva virusului.

În timpul studiilor speciale ale proteinelor virale totale din gel și pe membranele de nitroceluloză.

Imunoblotting (detecția anticorpilor în serul pacienților împotriva anumitor antigeni patogeni)

Procedura secțiunii Western blot are scopul de a determina infecția cu HIV în diferite stadii. În prima etapă, virusul purificat din părțile sale constitutive este supus electroforezei și antigenii incluși în acesta, împărțiți la greutatea moleculară.

Virusul imunodeficienței umane se reproduce în celulele vii încorporate în informațiile sale genetice. În această etapă, persoana devine purtătoare a virusului HIV dacă ați fost infectat.

Specificul acestei boli este că nu se manifestă mult timp. Virusul distruge limfocitele, astfel, imunitatea unei persoane scade și organismul devine incapabil să lupte împotriva infecțiilor.

Dacă HIV este tratat corect și în timp util, pacientul va trăi până la o vârstă înaintată. Lipsa tratamentului duce inevitabil la moarte. Din momentul infectării, dar fără tratament, perioada maximă nu este mai mare de zece ani.

Particularități

Analiza imunoblot este o metodă fiabilă care vă permite să determinați prezența anticorpilor la antigenele HIV de primul și al doilea tip.

Dacă o persoană este infectată, după două săptămâni de anticorpi, care pot fi depistați mult mai târziu. O caracteristică a HIV este că cantitatea de anticorpi crește rapid și rămâne în sângele pacientului. Chiar dacă sunt prezente, boala poate să nu se manifeste timp de doi sau mai mulți ani. Metoda ELISA nu indică întotdeauna cu exactitate prezența bolii, necesitând confirmarea rezultatelor din secțiunile PCR și Western blot dacă imunotestul enzimatic a arătat un rezultat pozitiv.

Indicatii pentru

Ce fel de „imunoblot” a fost deja descoperit, dar care este introdus în studiu?

Motivul testării pentru imunoblotul cu virusul imunodeficienței umane (HIV) va fi un rezultat pozitiv ELISA. Este necesar să treacă printr-un test imunosorbent legat de enzime la pacienții care urmează să fie supuși unei intervenții chirurgicale. În plus, ar trebui să faceți o analiză a femeilor care plănuiesc să rămână însărcinate, precum și a celor care sunt promiscue. Secțiunile Western blot sunt administrate pacienților cu infecție HIV dacă rezultatele elisa sunt discutabile.

Următoarele simptome alarmante pot fi motivul pentru care mergeți la medic: pierdere rapidă în greutate; slăbiciune, pierdere a funcției; tulburări intestinale (diaree), care durează trei săptămâni; deshidratare; febră; ganglioni limfatici umflați în organism; dezvoltarea candidozei, tuberculoză, pneumonie, toxoplasmoză, exacerbare a herpesului.

Pacientul nu trebuie să se pregătească înainte de a dona sânge venos.

Nu mâncați cu 8-10 ore înainte de test. Nu se recomandă cu o zi înainte de donarea sângelui să bei băuturi alcoolice și cafea, grele exercițiu pentru a experimenta entuziasm.

Unde se face analiza?

Unde pot fi testat pentru HIV?

ELISA, o analiză de imunoblot efectuată în clinici private urbane, dă rezultate într-o zi. Diagnosticul imediat este, de asemenea, posibil. in institutiile publice, teste medicale elisa și secțiunea Western blot gratuit, în conformitate cu legislația Federației Ruse.

Screening obligatoriu pentru bolile infecțioase ale femeilor însărcinate și ale pacienților care necesită spitalizare sau intervenție chirurgicală Cum este realizat acest studiu?

Cum se efectuează un ELISA? Imunoblot pozitiv/negativ confirmă sau infirmă rezultatele elisa. Procedura este destul de simplă. Specialistul ia sânge venos, în timp durează mai puțin de cinci minute.

După prelevare, locul de injectare trebuie dezinfectat și sigilat cu un ipsos. Eșantionarea se efectuează pe stomacul gol, așa că după procedură nu strica să mănânci un baton de ciocolată neagră sau o băutură caldă dulce.

Pentru a obține o recomandare pentru o analiză gratuită la o instituție medicală publică, trebuie să vizitați un terapeut.

În general, imunoblotul nu diferă de alte teste de sânge prin prelevare. Metodologia cercetării este simplă. Dacă un virus este prezent în sângele unei persoane, organismul începe să producă anticorpi pentru a-l distruge. Există multe antigene proteice pentru fiecare virus. Detectarea acestor anticorpi este baza metodei de secționare Western blot. Preț

Câtă analiză? Imunoblot HIV se referă la cercetare ieftină.

În medie, metodele de imunotestare de screening variază de la 500 la 900 de ruble. Secțiunile Western blot sunt un control de studiu, al cărui cost variază de la trei la cinci mii de ruble. Metodele mai complexe sunt mult mai scumpe. De exemplu, pentru analiza reacției în lanț a polimerazei (PCR), va trebui să plătiți aproximativ 12.000 de ruble.

Interpretarea rezultatelor

Cele mai comune metode de diagnosticare a infecției cu HIV sunt imunotestul enzimatic și imunoblot.

Sunt pentru determinarea anticorpilor serici împotriva virusului imunodeficienței umane. Infecția este de obicei confirmată prin două teste: screening și confirmator. Interpretarea rezultatelor ar trebui făcută de un medic, el diagnostichează și prescrie tratament. Dacă imunoblotul este pozitiv, înseamnă că corpul uman virus.

Un rezultat pozitiv nu ar trebui să fie un motiv pentru auto-tratament, deoarece fiecare pacient poate avea propria sa imagine a bolii.

Analiza calitativă include screening și certificare. Dacă pacientul nu are virusul, rezultatul este „negativ”. Când acest certificat este găsit, sunt efectuate teste suplimentare de screening. Analiza imunoblot care confirmă sau infirmă screening-ul. Dacă benzile de testare apar în întunecarea anumitor zone (localizarea proteinelor), diagnosticul este „HIV”.

Dacă rezultatele sunt îndoielnice, atunci testele sunt efectuate în termen de trei luni.

Pentru a preveni infectarea cu virusul imunodeficienței umane, este posibil dacă respectați anumite reguli: evitați contactul sexual ocazional, folosiți prezervative în timpul contactului, nu utilizați medicamente.

Dacă boala este detectată la o femeie însărcinată, este important să urmați recomandările medicului curant, nu uitați de testele pentru prezența virusului.

Ce este Western Blotting?

Identificarea proteinelor în amestecuri complexe sau extracte din diferite țesuturi este una dintre problemele frecvent întâlnite. Folosind un astfel de instrument ca anticorpi specifici, este posibil să se determine proteina studiată cu un minim de timp și costuri financiare.

În metoda Western blotting, în prima etapă, un amestec de proteine este separat prin electroforeză în prezența dodecil sulfatului de sodiu (SDS), apoi transferat pe o membrană de nitroceluloză prin electroblotting.

Esența acestei metode constă în faptul că gelul după electroforeză este plasat pe o membrană de nitroceluloză între straturi de hârtie de filtru. „Sandvișul” asamblat în acest fel este plasat într-un câmp electric astfel încât complexele proteină-SDS să se deplaseze peste placa de gel și să fie imobilizate (ca rezultat al sorbției nespecifice) pe suprafața membranei de nitroceluloză.

În legarea complexului proteină-SDS de membrana de nitroceluloză sunt implicate în principal forțe electrice, iar această interacțiune este multipunctivă și duce la „împrăștierea” proteinelor pe suprafața membranei. Astfel, după electrotransfer, obținem o replică a gelului pe nitroceluloză cu proteine dispuse la fel ca în gelul de poliacrilamidă.

După SDS - electroforeză, electrotransfer și sorbția proteinelor din gel pe o membrană de nitroceluloză, conformația terțiară a proteinei este mult modificată, dacă în general este corect să vorbim despre existența unei structuri terțiare pentru proteină după un tratament atât de dur. . Prin urmare, pentru detectarea imunochimică a proteinei studiate, sunt utilizați de obicei doar anticorpi mono- sau policlonali specifici regiunilor liniare ale moleculei proteice.

51. Imunotest enzimatic, imunoblot. Mecanism, componente, aplicație.

Anticorpii specifici pentru epitopii conformaționali (sau situsurile care implică contacte între subunități) nu sunt, în general, adecvați pentru utilizare în metoda Western blot.

După transferul proteinei, membrana este incubată secvenţial cu anticorpi specifici proteinei studiate, iar apoi cu anticorpi secundari specifici pentru fragmentele Fc ale anticorpilor primari, conjugaţi cu o etichetă enzimatică (sau un alt) (Fig.

1 A). În cazul în care anticorpii primari specifici antigenului studiat sunt conjugați direct cu eticheta, anticorpii secundari nu sunt necesari (Fig. 1 B). Complexele imune formate la locul localizării proteinei studiate sunt „manifestate” cu ajutorul unui substrat cromogen (în funcție de tipul etichetei).

Sensibilitatea și specificitatea metodei sunt foarte dependente de anticorpii utilizați în studiu.

Anticorpii utilizați trebuie să fie specifici pentru o secvență unică de aminoacizi specifică numai proteinei studiate. În caz contrar, este posibilă interacțiunea (mai ales în cazul extractelor de proteine grosiere) a anticorpilor cu mai multe molecule de proteine, ceea ce la rândul său va duce la apariția mai multor benzi colorate pe membrană.

Identificarea proteinei studiate în acest caz este adesea dificilă sau chiar imposibilă.

Al doilea factor important de avut în vedere atunci când alegeți anticorpi este afinitatea. Cu cât afinitatea anticorpilor utilizați este mai mare, cu atât benzile proteice colorează mai luminoase și mai clare, cu atât sensibilitatea metodei este mai mare. Când se utilizează anticorpi cu afinitate mare, se poate obține o sensibilitate de 1 ng și chiar mai mare.

Pentru a vizualiza rezultatul interacțiunii dintre antigenul legat de membrană și anticorpii, se folosesc anticorpi secundari conjugați cu agenți capabili să dea un anumit semnal în anumite condiții.

De obicei, se folosește ca astfel de agent o enzimă (peroxidază sau fosfatază), al cărei produs de reacție are o culoare și precipită pe membrană sub formă de precipitat insolubil.

De asemenea, în aceasta metoda pot fi utilizate etichete fluorescente.

Orez. 1. Schema de colorare imunochimică a proteinei studiate: A - folosind anticorpi secundari conjugați cu o etichetă enzimatică; B - anticorpul primar este conjugat direct cu o etichetă enzimatică.

Protocol:

I. Prepararea gelului și membranelor și electrotransferul proteinelor

Gelul de poliacrilamidă după electroforeză a fost plasat într-o baie cu tampon de blotting (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicină, 10% etanol).

Două coli de hârtie de filtru, tăiate după forma casetei de blotting și umezite cu tampon de blotting, sunt plasate pe partea casetei care va fi îndreptată spre anod. Apoi, pe hârtia de filtru se pune o membrană de nitroceluloză pre-umezită cu același tampon, asigurându-se că între membrană și hârtie nu există bule de aer.

După aceea, gelul trebuie așezat cu grijă pe membrană, întorcându-se din nou Atentie speciala pentru absența bulelor de aer între gel și membrană. Sandvișul este completat de două straturi de hârtie de filtru umezită, care sunt așezate pe suprafața gelului (Fig. 2). Sandvișul rezultat este prins în casetă și plasat între electrozi, astfel încât membrana să fie orientată spre anod.

Orez. 2. Schema electrotransferului proteinelor către membrană.

II. electrotransfer

Electrotransferul proteinelor pe o membrană de nitroceluloză se efectuează într-un tampon care conține 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicină, 10% etanol timp de 30-50 min la o tensiune constantă de 100 V.

Timpul de electrotransfer depinde de mărimea proteinelor transferate, cu cât proteina este mai mare, cu atât electrotransferul durează mai mult. Calitatea electrotransportului și aranjarea benzilor proteice se evaluează prin colorarea membranei de nitroceluloză cu o soluție 0,3% de Ponceau S în 1% acid acetic. Înainte de imunocolorare, membrana trebuie spălată de mai multe ori cu o soluție apoasă de Tris ușor alcalină pentru a îndepărta colorantul legat de proteine.

III. Colorarea imunochimică a proteinelor imobilizate pe o membrană de nitroceluloză

Pentru a bloca situsurile de legare a anticorpilor nespecifici, membrana este incubată cu agitare constantă la temperatura camerei timp de 30 de minute în PBST (pentru o mai bună blocare, se poate folosi o soluție PBST care conține 10% lapte praf degresat).

După blocare, membrana este incubată timp de o oră la temperatura camerei cu agitare constantă în PBST care conține 1-10 μg/ml de anticorpi specifici.

Concentrația optimă de anticorpi este selectată empiric și depinde de afinitatea interacțiunii anticorpilor cu antigenul.

La sfârșitul incubării, membrana a fost spălată de 5 ori cu PBST și transferată într-o soluție de anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean. Diluția conjugatului este de obicei indicată de producător pe ambalaj sau este selectată empiric de către cercetător. Se incubează membrana într-o soluție de anticorpi secundari timp de 1 oră cu agitare constantă.

După spălare minuțioasă (cel puțin 5-6 modificări tampon), membrana PBST este transferată într-o soluție de substrat cromogenă care conține 3 mg diaminobenzidină (DAB) și 10 µl de peroxid de hidrogen 30% în 10 ml de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,6 .

Incubarea se efectuează cu agitare timp de 5 până la 10 minute. După terminarea incubării cu substratul, membrana trebuie spălată cu PBST, uscată prin tamponare cu hârtie de filtru și imediat făcută o copie electronică prin scanare color. Dacă membrana se usucă complet, dungile proteice vopsite se estompează, iar imaginea este mai puțin strălucitoare și contrastantă.

Notă: DAB este toxic și un potențial cancerigen. Lucrați numai cu mănuși de cauciuc!