Bağışıklık lekesi pozitif. immünoblotlama hiv pozitif

Bağışıklık lekesi (immunoblot, Western Blot, Western blot)- enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile virüs antijenlerinin bir nitroselüloz şeride (şeride) ön elektroforetik transferi ile birleştirir.

Bu güzel bilimsel isimde, "leke" büyük olasılıkla "leke" olarak tercüme edilir ve "batı", "batı" olarak tercüme edilir, bu "leke" nin kağıt üzerindeki dağılım yönünü soldan sağa, yani coğrafi bir harita üzerinde yansıtır. bu da batıdan doğuya olan yöne karşılık gelir." "İmmün leke" yönteminin özü, immünoenzimatik reaksiyonun bir antijen karışımı ile değil, daha önce immünoforez yoluyla bir nitroselüloz zarın yüzeyinde moleküler ağırlığa göre yerleştirilmiş fraksiyonlara dağıtılan HIV antijenleri ile gerçekleştirilmesidir. Sonuç olarak, antijenik determinantların taşıyıcıları olan HIV'in ana proteinleri, enzim immün testi sırasında ortaya çıkan ayrı bantlar şeklinde yüzey üzerinde dağılır.

İmmunoblot birkaç aşama içerir:

Şerit hazırlığı. Daha önce saflaştırılarak bileşenlerine ayrılan immün yetmezlik virüsü (HIV), elektroforeze tabi tutulurken, HIV'i oluşturan antijenler moleküler ağırlıklarına göre ayrıştırılıyor. Ardından, lekeleme yoluyla ("kurutma kağıdı" üzerindeki fazla mürekkebi sıkmaya benzer), antijenler artık gözle görülemeyen HIV'e özgü antijenik bantların bir spektrumunu içeren bir nitroselüloz şeridine aktarılır.

Örnek çalışma. Test materyali (serum, hastanın kan plazması vb.) nitroselüloz şeride uygulanır ve numunede spesifik antikorlar varsa, bunlar tam olarak karşılık gelen (tamamlayıcı) antijenik bantlara bağlanır. Sonraki manipülasyonların bir sonucu olarak, bu etkileşimin sonucu görselleştirilir - görünür kılınır.

Sonucun yorumlanması. Nitroselüloz plakanın belirli alanlarında bantların varlığı, çalışılan serumda kesin olarak tanımlanmış HIV antijenlerine karşı antikorların varlığını doğrular.

Şerit A - Pozitif kontrol

Şerit B - Zayıf pozitif kontrol

Şerit C - Negatif Kontrol

Strip D - Pozitif örnek (HIV-1'e karşı antikorlar saptandı)

Şu anda, test serumunda virüse özgü antikorların varlığını doğrulamak için ana yöntem immün lekelemedir (immunoblot). Bazı HIV enfeksiyonu vakalarında, serokonversiyon gelişmeden önce, spesifik antikorlar yöntemle daha etkili bir şekilde tespit edilir. bağışıklık lekesi ELISA'dan daha. Bir immün lekeleme çalışması, gp 41'e karşı antikorların en sık AIDS hastalarının serumlarında saptandığını ve profilaktik amaçlarla incelenen kişilerde p24'ün saptanmasının HIV enfeksiyonunun varlığı için ek çalışmalar gerektirdiğini ortaya koydu. Genetik olarak tasarlanmış rekombinant proteinlere dayalı immünoblot test sistemlerinin, saflaştırılmış virüs lizatına dayalı geleneksel sistemlerden daha spesifik olduğu kanıtlanmıştır. Bir rekombinant antijen kullanıldığında, diffüz değil, açıkça tanımlanmış, muhasebe ve değerlendirme için kolayca erişilebilen dar bir antijen bandı oluşur.

HIV-1 ile enfekte kişilerin serumu, aşağıdaki ana proteinlere ve glikoproteinlere karşı antikorları saptar - yapısal zarf proteinleri (env) - gp160, gp120, gp41; çekirdekler (gag) - p17, p24, p55 ve ayrıca virüs enzimleri (pol) - p31, p51, p66. HIV-2 için, env'ye karşı antikorlar tipiktir - gp140, gp105, gp36; tıkaç - p16, p25, p56; pol-p68.

Reaksiyonun özgüllüğünü belirlemek için gerekli laboratuvar yöntemleri arasında, HIV-1 zarf proteinlerine - gp41, gp120, gp160 ve HIV-2 - gp36, gp105, gp140'a karşı antikorların tespiti en büyük tanıma sahiptir.

DSÖ, herhangi iki HIV glikoproteinine karşı antikorlar immünoblotlama ile tespit edilirse serumları pozitif kabul eder. Bu önerilere göre, zarf proteinlerinden (rp 160, rp 120, rp 41) sadece biri ile kombinasyon halinde veya diğer proteinlerle reaksiyon olmadan reaksiyon varsa, sonuç şüpheli kabul edilir ve bir kit kullanılarak ikinci bir test yapılması önerilir. başka bir seriden veya başka bir şirketten. Bundan sonra sonuç şüpheli kalırsa, 6 ay gözlem önerilir (3 ay sonra araştırma).

p24 antijeni ile pozitif bir reaksiyonun varlığı, bazen önce bu proteine karşı antikorlar ortaya çıktığından, bir serokonversiyon dönemine işaret edebilir. Bu durumda klinik ve epidemiyolojik verilere bağlı olarak en az 2 hafta sonra alınan serum örneği ile çalışmanın tekrarlanması önerilir ve bu tam olarak HIV enfeksiyonunda eşli serumların gerekli olduğu durumlarda geçerlidir.

Env proteinleri ile reaksiyon olmaksızın gag ve pol proteinleri ile pozitif reaksiyonlar, erken serokonversiyon aşamasını yansıtabilir ve ayrıca HIV-2 enfeksiyonunu veya spesifik olmayan bir reaksiyonu gösterebilir. HIV-2 testi yapıldıktan sonra bu tür sonuçlara sahip kişiler 3 ay sonra (6 ay içinde) yeniden muayene edilir.

İmmunoblot birkaç aşama içerir:

Şerit A - Pozitif kontrol

Şerit B - Zayıf pozitif kontrol

Şerit C - Negatif Kontrol

Strip D - Pozitif örnek (HIV-1'e karşı antikorlar saptandı)

Şu anda, test serumunda virüse özgü antikorların varlığını doğrulamak için ana yöntem immün lekelemedir (immunoblot). Bazı HIV enfeksiyonu vakalarında, serokonversiyondan önce spesifik antikorlar, ELISA'ya göre immünoblotlama ile daha etkili bir şekilde tespit edilir. Bir immün lekeleme çalışması, gp 41'e karşı antikorların en sık AIDS hastalarının serumlarında saptandığını ve profilaktik amaçlarla incelenen kişilerde p24'ün saptanmasının HIV enfeksiyonunun varlığı için ek çalışmalar gerektirdiğini ortaya koydu. Genetik olarak tasarlanmış rekombinant proteinlere dayalı immünoblot test sistemlerinin, saflaştırılmış virüs lizatına dayalı geleneksel sistemlerden daha spesifik olduğu kanıtlanmıştır. Bir rekombinant antijen kullanıldığında, diffüz değil, açıkça tanımlanmış, muhasebe ve değerlendirme için kolayca erişilebilen dar bir antijen bandı oluşur.

Bu nedir - immünoblot? Bu yaygın bir yöntemdir laboratuvar teşhisi viral enfeksiyonlar kişi. HIV varlığını tespit etmenin en doğru ve güvenilir yollarından biri olarak kabul edilir. Güvenilirliği açısından, immünoblotun sonuçları bile reddedilemez ve nihai olarak kabul edilir.

Genel bilgi

İmmunoblot - nedir bu? Bir kişide HIV enfeksiyonunu tanımak için, antikorların varlığı için bir laboratuvar kan serumu testinden geçmek gerekir. Western blot tekniğine Western blot da denir. Ek bir uzman yöntem olarak insan viral enfeksiyonlarını tespit etmek için kullanılır. Kandaki HIV antikorlarının varlığını belirlemenizi sağlayan bir laboratuvar testi olan ELISA'yı doğrulamak gerekir. Pozitif bir ELISA analizi, immünoblotlama ile yeniden kontrol edilir. En hassas, karmaşık ve pahalı olarak kabul edilir.

amaç

Bu nedir - immünoblot? Bu, virüse karşı antikorların varlığı için kan serumunun laboratuvar testi için bir tekniktir. Çalışma sırasında uzman, jeldeki virüs proteinlerini önceden ayırır ve nitroselüloz bir zara aktarır. İmmunoblotlama prosedürü, HIV'i belirlemek için tasarlanmıştır. Farklı aşamalar. İlk aşamada kendisini oluşturan parçalardan arındırılan virüs elektroforeze tabi tutulur ve bileşimini oluşturan antijenler moleküler ağırlıklarına göre ayrılır.

Genetik bilgisini içine yerleştirerek canlı bir hücrede çoğalır. Bu aşamada, kişi enfekte olmuşsa HIV virüsünün taşıyıcısı olur. Hastalığın özgüllüğü, uzun süre kendini göstermemesidir. Virüs lenfositleri yok eder, böylece insan bağışıklığı azalır ve vücut enfeksiyonlara karşı koyamaz hale gelir. HIV yetkin bir şekilde ve zamanında tedavi edilirse, hasta olgun bir yaşa kadar yaşayacaktır. Terapi eksikliği kaçınılmaz olarak ölüme yol açar. Enfeksiyon anından itibaren, ancak tedavi olmaksızın maksimum yaşam süresi on yıldan fazla değildir.

özellikler

İmmünoblot analizi, birinci ve ikinci tip HIV antijenlerine karşı antikorların varlığını belirlemenizi sağlayan güvenilir bir yöntemdir. Bir kişi enfekte olursa, antikorlar iki hafta içinde ortaya çıkar ve bu çok daha sonra tespit edilebilir. HIV'in özelliği, antikor sayısının hızla artması ve hastanın kanında kalmasıdır. Bulunsalar bile hastalık iki yıl veya daha uzun süre kendini göstermeyebilir. ELISA yöntemi, hastalığın varlığını her zaman doğru bir şekilde belirlemez, bu nedenle, enzim immün testi pozitifse, sonuçların immünoblotlama ve PCR kullanılarak doğrulanması gerekir.

Randevu endikasyonları

Bu "immünoblot" nedir zaten bulundu, ancak kime reçete edildi bu çalışma? İmmünoblotlama yöntemi için test yaptırmanın nedeni, pozitif bir ELISA sonucunun olmasıdır. Ameliyat olacak hastalara enzim immunoassay yaptırmak gerekir. Ayrıca gebelik planlayan kadınlar için olduğu kadar, cinsel ilişki yaşayan herkes için de analiz yapılmalıdır. cinsel hayat. ELISA sonuçları şüpheliyse, HIV'li hastalara immünoblotlama atayın. Aşağıdaki endişe verici belirtiler doktora gitme sebebi olabilir:

keskin kilo kaybı;
zayıflık, çalışma kapasitesi kaybı;
üç hafta süren bağırsak bozukluğu (ishal);
vücudun dehidrasyonu;
ateş;
arttırmak Lenf düğümleri vücut üzerinde;
kandidiyazis, tüberküloz, pnömoni, toksoplazmoz, herpes alevlenmesi gelişimi.

Hastanın venöz kan vermeden önce hazırlık yapmasına gerek yoktur. Çalışmadan 8-10 saat önce yemek yiyemezsiniz. Kan bağışından bir gün önce alkollü ve kahveli içeceklerin içilmesi, ağır fiziksel egzersizler yapılması, heyecan yaşanması önerilmez.

Analiz nerede yapılır?

HIV testi nerede yaptırabilirim? ELISA, immünoblot çalışmaları şehirdeki özel kliniklerde yapılıyor, sonuçlar bir gün içinde veriliyor. Anında teşhis de mümkündür. Devlet sağlık kurumlarında, Rusya Federasyonu mevzuatına uygun olarak ELISA testleri ve immünoblotlama ücretsiz olarak yapılmaktadır. Hamile kadınların yanı sıra hastaneye yatırılacak veya ameliyat olacak hastaların bulaşıcı hastalık testi yaptırması gerekmektedir.

Araştırma nasıl yapılır?

ELISA nasıl yapılır? Immunoblot pozitif/negatif, enzim immunoassay sonuçlarını doğrular veya reddeder. Araştırma prosedürü oldukça basittir. Uzman, beş dakikadan fazla sürmeyen bir venöz kan örneklemesi yapar. Örneklemeden sonra, enjeksiyon bölgesi dezenfekte edilmeli ve bir sıva ile kapatılmalıdır. Örnekleme aç karnına yapılır, bu nedenle işlemden sonra bir parça bitter çikolata yemekten veya tatlı bir sıcak içecek içmekten zarar gelmez.

Eyalette ücretsiz bir analiz için sevk almak için tıp kurumu bir pratisyen hekime gitmeniz gerekir. Genel olarak immünoblot, numune alma yöntemi açısından diğer kan testlerinden farklı değildir. Araştırma metodolojisi basittir. Bir kişinin kanında bir virüs varsa, vücut onu yok etmek için antikor üretmeye başlar. Her virüsün kendi antijen proteinleri seti vardır. Bu antikorların saptanması, Western blot tekniğinin temelidir.

Fiyat

Analizin maliyeti nedir? HIV için immünoblot, ucuz araştırma için geçerli değildir. Ortalama olarak, enzim immunoassay ile bir tarama incelemesinin maliyeti 500 ila 900 ruble arasındadır. İmmunoblotlama, maliyeti üç ila beş bin ruble arasında olan bir doğrulama çalışmasıdır. Daha karmaşık yöntemler çok daha pahalıdır. Örneğin, bunun için yaklaşık 12.000 ruble ödemeniz gerekecek.

sonucun yorumlanması

HIV enfeksiyonunu teşhis etmek için en yaygın yöntemler enzim immunoassay ve immunoblot'tur. İmmün yetmezlik virüsüne karşı serum antikorlarını belirlemek için kullanılırlar. Enfeksiyonun varlığı genellikle iki testle doğrulanır: tarama ve doğrulama. Çalışma sonuçlarının yorumlanması bir doktor tarafından yapılmalı, ayrıca teşhis koymalı ve tedaviyi reçete etmelidir. İmmunoblot pozitifse, bu, insan vücudunda bir virüs olduğu anlamına gelir.

Olumlu bir sonuç, kendi kendine tedavi için bir neden olmamalıdır, çünkü her hasta kendi hastalık resmine sahip olabilir. Kalitatif Analiz tarama ve doğrulamayı içerir. Hastada virüs yoksa sonuç “negatif” olarak belirtilir. Tarama yöntemi ile tespit edildiğinde ek doğrulama çalışması yapılır. Bir immünoblot, bir taramayı onaylayan veya reddeden bir analizdir. Test şeridinde belirli alanlarda (protein lokalizasyon bölgeleri) kararma görülürse, HIV teşhisi konur. Sonuçlarda şüphe varsa, testler üç ay içinde gerçekleştirilir.

Belirli kurallara uyarsanız bağışıklık yetmezliği virüsü bulaşmasını önleyebilirsiniz: rastgele seks yapmaktan kaçının, temas sırasında prezervatif kullanın, uyuşturucu almayın. Hamile bir kadında hastalık tespit edilirse, ilgili hekimin tavsiyelerine kesinlikle uymak önemlidir, virüs varlığı için muayene olmayı unutmayın.

Bulaşıcı hastalıkların laboratuvar teşhisi uygulamasında, bazen genel olarak bir patojene değil, belirli proteinlerine (antijenlere), yani spesifik antikorların bir spektrumuna karşı antikorların belirlenmesine ihtiyaç vardır. Bu amaçla enzime bağlı immünosorbent testi yöntemi kullanılıyorsa, bu durumda gerekli antijenleri patojen kültüründen izole etmek ve saflaştırmak gerekir. Ortaya çıkan proteinler, katı faza ayrı olarak uygulanır. 96 oyuklu bir plaka kullanılması durumunda - her oyukta bir tür antijen. Spesifik antikorlar daha sonra dolaylı bir yöntemle belirlenir.

Kuyuda bir veya başka bir antijen ile pozitif bir reaksiyonun varlığına göre, karşılık gelen spesifik antikorların varlığı yargılanabilir. Bu tür enzim immunoassay test sistemleri üreticiler tarafından sunulmaktadır, ancak daha fazla bilgi içeriği ve çalışmanın kendisinin uygulama kolaylığı nedeniyle, immün lekeleme yöntemi (Western blot) yaygınlaşmıştır.

İmmün lekeleme, kan serumundaki antikorların aynı anda ve aynı zamanda tüm teşhis testlerinden farklı olarak belirlenmesini mümkün kılar. önemli proteinler patojen. İngilizce Western blot'tan çeviri, western transfer anlamına gelir (kelimenin tam anlamıyla - leke). Bu sıra dışı terimin tarihi aşağıdaki gibidir.

1975 yılında Southern (E. Southern) adlı bir bilim adamı, elektroforetik olarak ayrılmış DNA fragmanlarının bir jelden bir zara aktarılması için bir yöntem önerdi. Yazara göre yönteme “güney transferi” anlamına gelen Southern blot adı verildi. Buna karşılık, RNA moleküllerini aktarma yöntemi, uzmanlar tarafından Northern blot - "kuzey transferi" olarak adlandırıldı. İlk başta şaka olarak ve daha sonra bu isim resmi bilimsel literatürde sabitlendi.

G. Toubin, 1979'da protein lekeleme üzerine ilk deneylerin sonuçlarını yayınladı. Biyolojik makromoleküllerin transferine yönelik yöntemlerin "coğrafi" adlarının geleneklerinin devamında, bu yöntem "Western" transfer - Western blot olarak bilinmeye başlandı.

Bu yöntemin ilk aşamasında, sodyum dodesil sülfat (SDS) varlığında bir poliakrilamid jel içindeki bir patojen protein karışımının elektroforetik ayrımı gerçekleştirilir. SDS, yüzeysel olmak aktif madde, protein moleküllerini düzgün bir şekilde sarar ve hepsine yaklaşık olarak eşit büyüklükte bir negatif yük verir. Bu nedenle, moleküller bir elektrik alanında bir yönde hareket eder ve hareket hızı yalnızca proteinin molekülünün boyutuna (molekül ağırlığı) bağlıdır.

Elektroforetik prosedür sonucunda, kalınlığında proteinlerin ayrı ince doğrusal bölgeler şeklinde yerleştirildiği bir jel plaka elde edilir. Hareket yönünde, aşağıdaki sıraya göre ayrılırlar: yaklaşık 120-150 kDa gibi büyük moleküler ağırlığa sahip proteinler başlangıca daha yakındır ve 5-10 kDa kütleye sahip proteinler bitiş çizgisine daha da ilerlemiştir. İkinci aşamada jel plaka bir nitroselüloz levha üzerine yerleştirilir ve bu yapı DC kaynağının elektrotları arasına yerleştirilir. Bir elektrik alanının etkisi altında, proteinler gözenekli jelden sıkıca sabitlendikleri daha yoğun bir zara akar.

Ortaya çıkan leke, antijenik olarak farklı olmayan proteinler ve/veya iyonik olmayan deterjanlar (Tween 20) içeren ve membran üzerinde antijen içermeyen bölgeleri bloke eden bir bloke edici solüsyonla işlenir. Zar tabakası daha sonra dar şeritler halinde kesilir, böylece her bir şerit tüm antijenik fraksiyonları içerir. Açıklanan adımlar üretici tarafından gerçekleştirilir.

İmmün lekeleme yoluyla antikorların saptanmasına yönelik ticari test sistemleri, analize hazır lekeler (şeritler veya şeritler) içerir. Kullanıcı, dolaylı yöntemin şemasına göre patojen proteinlerine yönelik spesifik antikorların tüm spektrumunu belirler. Bir renk (enzimatik) reaksiyonu gerçekleştirmek için bir kromojen olarak, ürünü bir renk kazanan, çözünmez hale gelen ve nitroselüloz üzerinde çökelen (çökelten) çözünür renksiz bir madde kullanılır.

Sıralı bağışıklık ve enzimatik reaksiyonların bir sonucu olarak, test örneğinde patojen proteinlere karşı antikorların varlığında, leke üzerinde konumu belirli patojen proteinlerinin bölgesinde olan koyu enine şeritler belirir. Bu tür bantların her biri, karşılık gelen antijene yönelik spesifik antikorların varlığını gösterir. İmmün lekeleme yöntemiyle yürütülen bir çalışmanın sonucu, patojenin spesifik proteinlerine karşı antikorların bir listesi şeklinde verilir. Örneğin: "p17 ve p24 proteinlerine karşı antikorlar tespit edildi."

Geliştirildikten sonra nitroselüloz lekesi, kurutulmuş halde uzun süre saklanabilir. Bununla birlikte, renk yoğunluğu önemli ölçüde zayıflar. Islak lekelerin fotoğrafları çekilebilir veya tarayıcılar kullanılarak grafik görüntüleri kişisel bilgisayarların belleğine girilebilir. Özel bilgisayar programları, dinamik izleme sırasında sonuçları işlemenize ve antikor spektrumunun dinamiklerini hızlı bir şekilde izlemenize olanak tanır.

immünoblotlama -(İngilizce "leke" - nokta) - bilinen serumları (veya antijenleri) kullanarak antijenleri (veya antikorları) tanımlama yöntemi. ELISA ile jel elektroforezinin bir kombinasyonudur. Başlangıçta bakteri hücreleri veya virionlar ultrason kullanılarak yok edilir ve ardından virüs veya bakteri hücrelerinin tüm antijenleri elektroforez ile ayrılır ve özel bir nitroselüloz film üzerinde ticari bir reaktif elde edilir. İmmün lekeleme kurulurken, hastanın test serumu, bilinen antijenlerle filme uygulanır. Bağlanmamış antikorların inkübasyonundan ve yıkanmasından sonra, filme bir enzimle işaretlenmiş insan immünoglobulinlerine karşı bir antiserum ve enzimle etkileşime girdiğinde renk değiştiren bir kromojenik substrat olan ELISA'ya geçerler. Antijen-antikor-antiserum-immünoglobulin-enzim komplekslerinin varlığında, taşıyıcı üzerinde renkli noktalar görülür. İmmunoblotlama yöntemi, patojenin çeşitli antijenlerine karşı antikorları ayrı ayrı tespit etmenizi sağlar (örneğin, HIV enfeksiyonunda, immünoblotlama, gp120, gp24 ve virüsün diğer antijenlerine karşı antikorları tespit eder).

Radyoimmünoassay (RIA)

Yöntem, bir radyonüklid ile bir antijen veya antikor etiketi kullanan antijen-antikor reaksiyonuna dayanır. 125I, 14C, 3H, 51Cr ve diğer radyonüklidler etiket olarak kullanılmaktadır. Ortaya çıkan bağışıklık kompleksleri sistemden izole edilir ve radyoaktiviteleri sayaçlar (β-radyasyon) üzerinde belirlenir. Radyasyon yoğunluğu, bağlı antijen ve antikor moleküllerinin sayısı ile doğru orantılıdır.

Polistiren panellerin oyuklarında adsorbe edilmiş etiketli antikorlar veya antijenler kullanan RIA'nın katı faz versiyonu yaygın olarak kullanılmaktadır.

RIA, mikropların, virüslerin, çeşitli hormonların, enzimlerin, tıbbi maddelerin, immünoglobulinlerin antijenlerinin yanı sıra 10–12–10–15 g/l'lik küçük konsantrasyonlarda test materyalinde bulunan diğer maddeleri tespit etmek için kullanılır.

test soruları

Bağışıklık bakteriyoliz reaksiyonu: ne tür bir reaksiyondur; antijen nedir, antikor nedir, reaksiyon mekanizması, evreleme yöntemleri, pratik kullanım. Bağışıklık hemoliz reaksiyonu: gerekli bileşenler, sertleştirme yöntemi; kontroller, pratik uygulama. Jelde lokal hemoliz reaksiyonu (Yerne reaksiyonu): reaksiyon prensibi, formülasyon yöntemi, pratik uygulama. Tamamlayıcı sabitleme reaksiyonu: reaksiyon prensibi; bağışıklık serumu belirli bir antijenle etkileşime girdiğinde ne oluşur; Bu etkileşimde varsa tamamlayıcıya ne olur? Antijen ve antikorlar arasında spesifik bir afinite yoksa komplemanın kaderi nedir? Tamamlayıcıya ne olduğunu belirlemek için hangi reaksiyon kullanılabilir; bu reaksiyon neden kullanılır; RSK'nın görünür olumlu sonucu nedir? Neden? Niye? CSC'nin ilk aşamasında tamamlayıcının hangi özelliği kullanılır? İkinci aşamada mı? RSK'nin nihai sonucu hemoliz ise, bu pozitif veya negatif bir sonuç anlamına mı gelir? Sonuçları açıklayın: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Birinci RSK sisteminin bileşenlerini ve ikinci RSK sisteminin bileşenlerini adlandırın. Test serumunun neden inaktive edilmesi gerekiyor? Kompleman nasıl titre edilir? Hemolitik serum: Ne içerir, nasıl elde edilir, titre nedir ve nasıl belirlenir? RSC bileşenlerini elde etmek için hangi hayvanlar kullanılır? RSC'yi soğukta ayarlama tekniği. Aşağıdaki reaksiyonlardan hangisinin evrelendirilmesinde bir tamamlayıcının katılımı gereklidir: çökeltme, flokülasyon, aglütinasyon, eksik antikorların tespiti, immün bakteriyoliz, immün hemoliz, Jerne, CSC? İmmünofloresan reaksiyonu (RIF) - doğrudan Coons reaksiyonundaki olayların sırasını gösterir; gerekli bileşenler. Antijen nedir, antikor nedir, antikorlar nasıl etiketlenir, reaksiyon sonucu nasıl dikkate alınır, pozitif sonuç nasıl olur? Pratik uygulama - bu reaksiyon kullanılarak ne belirlenebilir? Dolaylı immünofloresan reaksiyonu - bu reaksiyondaki olayların sırasını, gerekli bileşenleri, antijenin ne olduğunu, hangi immün serumların kullanıldığını belirtin; pratik kullanım; dolaylı RIF'in doğrudan reaksiyona göre avantajı. Bağlantılı immünosorbent deneyi(ELISA) - reaksiyon prensibi; gerekli bileşenler; test materyalinde bir antijeni saptamak için bir reaksiyon oluştururken olayların sırasını belirtir; gerekli bileşenler; olumlu bir sonuçla ne olur, neye benziyor? Test serumundaki antikorları saptamak için ELISA sırasındaki eylemlerin sırasını belirtin; gerekli bileşenler; Olumlu bir sonuçla ne olur? İmmunoblotlama - reaksiyon prensibi; ana adımlar; gerekli bileşenler; Sonuç nasıl dikkate alınır? reaksiyon faydaları. Radioimmunoassay (RIA) - reaksiyonun ana aşamaları nelerdir; Antikor veya antijenler ne ile işaretlenir, sonuç nasıl dikkate alınır? İmmünoelektron mikroskobu - yöntemin prensibi; ana adımlar; gerekli bileşenler; Antikorlar ne ile etiketlenir? reaksiyonun sonucu nasıl dikkate alınır. Hareketsizleştirme reaksiyonları - yöntemin ilkesi, ayar tekniği, bileşenler, sonuçların muhasebesi.

Kendi kendine eğitim sürecinde gerçekleştirilecek görevler.

Bu konuda ele alınan reaksiyonlar için Bağışıklık Reaksiyonları tablosunu doldurun.

Bağışıklık reaksiyonları

Uygulamalı bir derste öğrencinin çalışması

RSC'nin 1. aşamasının formülasyonu ile hemen çalışmaya başlayın, ancak bunu daha sonra bir not defterine yazın (aşağıya bakın).

1. İmmün hemoliz reaksiyonu. İmmün hemolizin bir gösteri reaksiyonunu görüntüleyin, bir diyagram olarak çizin, deney ve kontrol tüplerindeki sonucu açıklayın.

2. Tamamlayıcı bağlanma reaksiyonu

a) RSC'yi tabloya göre sökün;

b) bir deftere RSC'yi tablo şeklinde ayarlamak için bir şema çizin;

c) RSK'nın ikinci aşamasını koyun (ilk aşama dersin başına konur);

d) RSK için gerekli teşhis hazırlıklarını sökün;

e) sonucu dikkate almak. Test serumunda spesifik antikorların varlığı hakkında bir sonuç formüle edin.

3. İmmünofloresan reaksiyonu. Tabloyu inceleyin, not defterinizdeki reaksiyonu ayarlamak için bir şema çizin; teşhis serumlarına bakınız; serumun neler içerdiğini, nasıl hazırlandığını, hangi reaksiyon için (direkt veya indirekt RIF) kullanıldığını belirleyin. RIF'in bir flüoresan mikroskobundaki gösteri sonucuna bakın.

4. Enzim immün testi (ELISA). Defterinizde, iki versiyonda bir reaksiyon şeması çizin: test materyalinde bir antijenin tespiti için ve serumda antikorların tespiti için. HIV ve Hepatit B Teşhis Malzeme Kitini gözden geçirin Her bir bileşenin ne içerdiğini ve ne için kullanıldığını belirleyin.

5. İmmün lekeleme. Defterinizde reaksiyonun bir diyagramını yapın; demoya bakın - reaksiyonun sonucu.

6. Radyoimmunoassay (RIA). Reaksiyon şemasını defterinize çizin.

7. Bağışıklık elektron mikroskobu (IEM). Gösterimi izleyin - reaksiyonun sonucu, not defterinizde bir reaksiyon şeması çizin, antijeni (virüs) ve etiketli antikorları oklarla belirtin.

İmmunoblotlama, elektroforez ve ELISA veya RIA'nın bir kombinasyonuna dayanan oldukça hassas bir protein saptama yöntemidir. İmmunoblotlama şu şekilde kullanılır: teşhis yöntemi HIV enfeksiyonu vb.

Genel anlamda, immünoblotlama, kovalent bağlarla bağlandıkları katı bir destek zarına aktarılan bir protein karışımının analizi ve ardından immün saptama olarak anlaşılır.

Doğrudan bir substrat üzerinde biriken proteinlerin bir karışımını (nokta leke analizi) veya elektrofokuslama, disk elektroforezi veya iki boyutlu elektroforez (Western blotlama) ile ön fraksiyonasyonundan sonra analiz etmek mümkündür.

Patojen antijenler, poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılır, daha sonra jelden aktifleştirilmiş kağıt veya nitroselüloz membrana aktarılır ve ELISA ile geliştirilir.

Firmalar bu tür şeritleri antijen "lekeleri" ile üretirler. Bu şeritlere hastanın serumu uygulanır. . Daha sonra inkübasyondan sonra hasta, hastanın bağlanmamış antikorlarından yıkanır ve enzimle işaretlenmiş insan immünoglobulinlerine karşı serum uygulanır. . Şerit üzerinde oluşan kompleks (antijen + hastanın antikoru + insan Ig'ye karşı antikor), enzimin etkisi altında renk değiştiren bir kromojenik substrat eklenerek tespit edilir.

Bu metodoloji aynı zamanda hedef klonlanmış genlerin ürünlerini ifade eden bakteri, faj veya virüs klonlarının seçimine de uygulanır.

Proteinlerin zara transferi pasif olarak veya elektrotransfer aparatları kullanılarak gerçekleştirilir. Zara protein transferinin etkinliği, proteinlerin moleküler ağırlığı, jelin gözenekliliği, transfer süresi ve kullanılan tampon çözeltinin (trans tampon) bileşimi gibi birçok faktörden etkilenir.

Deneyin görevlerine ve koşullarına bağlı olarak, en iyi sonuçları sağlayan transfer koşulları seçilir. Yaygın olarak kullanılan substratlar, nitroselüloz, poliviniliden diflorür (PVDF) veya pozitif yüklü naylon membranlardır. Nitroselüloz 1 cm2 başına 80-100 mikrograma kadar protein bağlayabilir.

Düşük molekül ağırlıklı proteinler (molekül ağırlığı 20 kDa'dan az olan) yıkamalar sonucunda kaybolabilir, bu da belirli genetik lokusların polimorfizminin karşılık gelen kısıtlama DNA fragmanlarının uzunlukları ile önceden incelenmesini mümkün kılar.

Ek olarak, Southern hibridizasyonunu kullanarak, hedef genin iç kısmında belirli bir kısıtlama enzimi tarafından bir hidroliz bölgesine sahip olup olmadığını bulmak kolaydır; bu, incelenen genom bölgesini klonlamak için en uygun stratejiyi seçmenize olanak tanır.

Benzer bir şemaya göre, RNA molekülleri agaroz jelden bir nitroselüloz filtreye de aktarılabilir. Bu yönteme Southern blotlamanın aksine Northern blot adı verilmiştir, çünkü ingilizce dili"güney" anlamına gelir.

Protein jelinden filtrelere transfer buna göre Western blot olarak adlandırıldı. Trans tamponda etanol varsa, sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisinde denatüre edilmiş büyük proteinler (100 kDa'dan büyük) zara zayıf bir şekilde aktarılabilir. Alkol, proteinlerin SDS-poliakrilamid jelden transferini önemli ölçüde iyileştirir, ancak jeldeki gözenekleri daraltarak büyük proteinlerin tutulmasına yol açar.

PVDF membranı, immün saptama için optimize edilmiştir ve çok düşük bir spesifik olmayan bağlanma seviyesi ile 160 µg/cm2'ye kadar spesifik olarak bağlı proteinleri tutabilir.

immünoblotlama

Bu zarın önemli bir özelliği, tekrar tekrar kullanım olasılığıdır. Zeta-Probe naylon membranları, alkol yokluğunda SDS proteinlerini etkili bir şekilde bağlar ve bu bağlanma sonraki işlemlere dirençlidir. Düşük moleküler ağırlıklı proteinler de etkili bir şekilde tutulur. 1 cm2 başına yaklaşık 480 μg protein gibi yüksek bağlama kapasitesine sahip Zeta-Probe membranları, tahlil karışımlarında eser miktarda proteinin saptanmasına olanak tanır.

Antijen zar üzerinde immobilize edildikten sonra, kalan bağlanma bölgeleri jelatin veya sığır serum albümini veya yağsız süt solüsyonları ile bloke edilir.

Daha sonra membran, test edilen antijene yönelik poliklonal veya monoklonal antikorların bir solüsyonunda inkübe edilir. Bağlanmamış antikorların yıkanmasından sonra, membran, alkalin fosfataz enzimlerinin (alkali fosfataz, AP) veya yaban turpu peroksidazının (HRP) anti-tür antikorları (tavşan, fare veya keçiye karşı keçi antikorları) ile eşleniği olan ikincil antikorların bir solüsyonunda inkübe edilir. insan immünoglobulinleri) veya immünoglobülinlerin Fc bölgesi için yüksek bir afiniteye sahip proteinler A (Staphylococcus aureus proteini) veya G (Streptococcus sp. proteini).

Oluşan bağışıklık komplekslerinin tespiti, kimyasal veya kemilüminesan yöntemle gerçekleştirilir. Alkalin fosfataz konjugatları kullanılırken kimyasal reaksiyon için substratlar 5-bromo-4-kloro-3-indolilfosfat (BCIP) veya tetrazolyum mavisidir (NBT) ve yaban turpu peroksidaz konjugatları - 4-kloro-1-naftol ve hidrojen peroksit kullanılır.

Enzimatik reaksiyonlar sonucunda, antijen-antikor kompleksinin lokalizasyon bölgesinde zar üzerinde renkli bir bant veya nokta oluşur.

Bu yöntemin hassasiyeti AP konjugatları kullanıldığında 100 pg protein, HRP konjugatları kullanıldığında ise 100-500 pg proteindir. Bağışıklık komplekslerinin kemilüminesan tespiti, 5 pg'den daha az antijeni tespit edebilir. Bu yöntemin prensibi, HRP'nin hidrojen peroksit ve siklik diasilhidrazineluminol ile reaksiyona girdiğinde, ışığa duyarlı bir film üzerine kaydedilebilen 428 nm dalga boyunda ışık yaymasıdır.

İmmün lekeleme reaksiyonu (RI), ELISA temelinde geliştirilmiştir. İmmünokimyasal analizlerin en spesifik ve hassas yöntemidir. İmmunoblotlama (İngiliz lekesinden - ıslanmak, lekelenmek) ELISA'yı elektroforez ile birleştirir. HIV'e karşı karmaşık antikorları değil, bireysel yapısal proteinlerine (proteinler-p24, glikoproteinler-gp120, gp 41, vb.) Karşı antikorları tespit etmek için kullanılır. HIV enfeksiyonunun teşhisi için uzman (doğrulayıcı) reaksiyonlarına bakın.

Reaksiyon birkaç aşamada gerçekleştirilir:

Virüs, bir poliakrilamid jelde elektroforeze tabi tutulan, yani antijenlerin moleküler ağırlığa göre fraksiyonlara ayrılması olan bileşenler - antijenler (p24, gp120, gp 41, vb.) halinde yok edilir.

2. Jel, bir nitroselüloz zar ile kaplanır ve antijen fraksiyonları, elektroforez yoluyla ona aktarılır. Nitroselüloz kurutma kağıdı gibi davranır. Membran şeritler (şeritler) halinde kesilir. Firmalar bu tür şeritleri antijen "lekeleri" ile üretirler.

İmmunoblotlama - ek bir dolaylı yöntem

Üzerine HIV antijenleri uygulanmış şeritler deneğin serumuna daldırılır ve daha sonra bağlanmamış malzemeden yıkanır.

4. Stripler, peroksidaz etiketli antiglobulin serum ile inkübe edilir ve yıkanır.

Bir substrat eklenir ve AG-AT kompleksinin lokalizasyon bölgesine karşılık gelen renkli fraksiyonların (noktalar) sayısı not edilir.

Şeridin belirli alanlarında şeritlerin varlığı, çalışılan serumda kesin olarak tanımlanmış HIV antijenlerine karşı antikorların varlığını doğrular. Üç HIV antijeninden (p24, gp41 ve gp 120) herhangi ikisine karşılık gelen bantlar zar üzerinde görünürse, immünoblotlamanın sonucu pozitif kabul edilir (Şekil 37).

ÇİZİMLER

KULLANILAN LİTERATÜR LİSTESİ

Ana literatür

Tıbbi mikrobiyoloji, viroloji ve immünoloji: tıp öğrencileri için bir ders kitabı. üniversiteler 2. baskı, düzeltildi. ve ek — 702 s. Ed. A.A. Vorobyov. M. : MIA, 2012.

2. Mikrobiyoloji, viroloji ve immünoloji: laboratuvar çalışmaları için bir rehber: çalışma rehberi / (V.B. Sboychakov ve ark.); ed. V.B.Sboychakova, M.M.Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 pp.: hasta.

3. Tıbbi mikrobiyoloji, immünoloji ve viroloji [Elektronik kaynak]: bal için bir ders kitabı.

üniversiteler - 760 s. — Erişim modu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Petersburg: Spetslit, 2010.

4. Tıbbi mikrobiyoloji, viroloji ve immünoloji [Elektronik kaynak]: ders kitabı: 2 cilt / V. 1. - 448 s. — Erişim modu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M. : Geotar Medya, 2010. .

5. Tıbbi mikrobiyoloji, viroloji ve immünoloji [Elektronik kaynak]: ders kitabı: 2 cilt Cilt 2 - 480 s. Erişim modu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M. : Geotar Medya, 2010.

ek literatür

1. İmmünodiagnostik reaksiyonlar: öğretici/ derleyen: G.K. Davletshina, Z.G. Gabidullin, A.A. Akhtariyeva, M.M.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Rusya Sağlık Bakanlığı GBOU VPO BSMU Yayınevi, 2016. - 86s.

2. Enterobacter, Сitrobacter, Serratia, E. coli, Proteus bakterilerinin birlikte yetiştirilen varyasyonlarının patojenik potansiyelini belirleyen bazı özelliklerin özellikleri: bilimsel yayın / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 saniye

ana » İmmunoblot - nedir bu? Teşhiste immünoblot bulaşıcı hastalıklar

İmmunoblot - nedir bu? Bulaşıcı hastalıkların tanısında immünoblot

immünoblot nedir? Bu, insan viral enfeksiyonlarının laboratuvar teşhisi için yaygın bir yöntemdir. HIV varlığını tespit etmenin en doğru ve güvenilir yollarından biridir.

Güvenilirlik açısından enzim eşli immünosorbent (elisa) testinden bile daha büyüktür. İmmunoblot sonuçları kesin ve kati kabul edilir.Genel Bilgiler

İmmunoblot - nedir bu? Bir kişiyi HIV pozitif olarak tanımak için, kan serumunda antikor varlığını test etmek için bir laboratuvar testinden geçmelisiniz.

Western blot bölümlerinin yöntemine Western blot (Western blot) da denir. Ek bir uzman yöntemi olarak insan viral enfeksiyonlarını tespit etmek için kullanılır. Bu, kanda HIV'e karşı antikorların varlığını belirlemenizi sağlayan bir laboratuvar testi olan ELISA'yı doğrulamak için gereklidir. İmmunoblot yeniden kontrol pozitif ELISA.

En hassas, karmaşık ve pahalı olarak kabul edilir.

Hedef

immünoblot nedir? Bu teknik laboratuvar araştırması virüse karşı antikorların varlığı için kan serumu.

Jeldeki ve nitroselüloz zarlardaki toplam viral proteinlerin özel çalışmaları sırasında.

İmmunoblotlama (hastaların serumlarında belirli patojen antijenlere karşı antikorların tespiti)

Western blot bölümü prosedürünün amacı, HIV enfeksiyonunu farklı aşamalarda belirlemektir. İlk adımda, kendisini oluşturan parçalardan saflaştırılan virüs elektroforeze tabi tutulur ve içerdiği antijenler moleküler ağırlığa bölünür.

İnsan immün yetmezlik virüsü, genetik bilgisine gömülü canlı hücrelerde çoğalır. Bu aşamada, eğer enfekte olduysanız, kişi HIV virüsünün taşıyıcısı olur.

Bu hastalığın özelliği, uzun süre kendini göstermemesidir. Virüs lenfositleri yok eder, böylece kişinin bağışıklığı azalır ve vücut enfeksiyonlarla savaşamaz hale gelir.

HIV doğru ve zamanında tedavi edilirse, hasta olgun bir yaşa kadar yaşayacaktır. Tedavi eksikliği kaçınılmaz olarak ölüme yol açar. Enfeksiyon anından itibaren, ancak tedavi olmaksızın maksimum süre on yılı geçmez.

özellikler

İmmünoblot analizi, birinci ve ikinci tip HIV antijenlerine karşı antikorların varlığını belirlemenizi sağlayan güvenilir bir yöntemdir.

Bir kişi enfekte olursa, çok sonra tespit edilebilen antikorlar iki hafta sonra. HIV'in bir özelliği, antikor miktarının hızla artması ve hastanın kanında kalmasıdır. Bulunsalar bile hastalık iki yıl veya daha uzun süre kendini göstermeyebilir. ELISA yöntemi, hastalığın varlığını her zaman doğru bir şekilde göstermez ve enzim immün testinin pozitif bir sonuç göstermesi durumunda, PCR ve Western blot bölümlerinden sonuçların doğrulanmasını gerektirir.

için endikasyonlar

Halihazırda ne tür bir "immünoblot" bulundu, ancak çalışmada hangisi tanıtılıyor?

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) immünoblotunun test edilmesinin nedeni, olumlu bir sonuç ELISA. Ameliyat olacak hastalarda enzime bağlı immünosorbent testinden geçmek gerekir. Ek olarak, hamilelik planlayan kadınların yanı sıra rastgele olanların da bir analizini yapmalısınız. Elisa sonuçları şüpheliyse, HIV enfeksiyonu olan hastalara Western blot kesitleri verilir.

Aşağıdaki endişe verici semptomlar doktora gitme sebebi olabilir: hızlı kilo kaybı; halsizlik, fonksiyon kaybı; üç hafta süren bağırsak bozuklukları (ishal); dehidrasyon; ateş; vücutta şişmiş lenf düğümleri; kandidiyazis gelişimi, tüberküloz, pnömoni, toksoplazmoz, herpes alevlenmesi.

Hastanın venöz kan vermeden önce hazırlık yapmasına gerek yoktur.

Testten 8-10 saat önce yemek yemeyin. Kan bağışından bir gün önce alkollü ve kahveli içeceklerin, ağır içeceklerin tüketilmesi önerilmez. egzersiz yapmak heyecan yaşamak.

Analiz nerede yapılır?

HIV testi nerede yaptırabilirim?

Kentsel özel kliniklerde yapılan immünoblot analizi ELISA, bir gün içinde sonuç veriyor. Anında teşhis de mümkündür. kamu kurumlarında, tıbbi testler elisa ve Western blot bölümü, Rusya Federasyonu mevzuatına uygun olarak ücretsiz.

Gebelerde enfeksiyon hastalıkları, hastanede yatış veya ameliyat gerektiren hastalarda zorunlu tarama var mı Bu çalışma nasıl yapılıyor?

ELISA nasıl yapılır? Immunoblot pozitif/negatif, elisa sonuçlarını doğrular veya reddeder. İşlem oldukça basit. Uzman venöz kan alır, zamanında beş dakikadan az sürer.

Örneklemeden sonra, enjeksiyon bölgesi dezenfekte edilmeli ve bir sıva ile kapatılmalıdır. Örnekleme aç karnına yapılır, bu nedenle işlemden sonra bir parça bitter çikolata veya tatlı bir sıcak içecek yemekten zarar gelmez.

Bir kamu sağlık kurumunda ücretsiz analiz için havale almak için bir terapisti ziyaret etmelisiniz.

Genel olarak, immünoblot, örnekleme yoluyla diğer kan testlerinden farklı değildir. Araştırma metodolojisi basittir. Bir kişinin kanında bir virüs varsa, vücut onu yok etmek için antikor üretmeye başlar. Her virüs için birçok protein antijeni vardır. Bu antikorların saptanması, Western blot kesit alma yönteminin temelidir. Fiyat

Ne kadar analiz? Immunoblot HIV, ucuz araştırmayı ifade eder.

Ortalama olarak, tarama immünoassay yöntemleri 500 ila 900 ruble arasında değişmektedir. Western blot bölümleri, maliyeti üç ila beş bin ruble arasında değişen bir çalışma kontrolüdür. Daha karmaşık yöntemler çok daha pahalıdır. Örneğin, polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) analizi için yaklaşık 12.000 ruble ödemeniz gerekecek.

Sonuçların yorumlanması

HIV enfeksiyonunu teşhis etmek için en yaygın yöntemler enzim immunoassay ve immunoblot'tur.

İnsan immün yetmezlik virüsüne karşı serum antikorlarının belirlenmesi içindir. Enfeksiyon genellikle iki testle doğrulanır: tarama ve doğrulama. Sonuçların yorumlanması bir doktor tarafından yapılmalı, tedaviyi teşhis eder ve reçete eder. İmmünoblot pozitifse, bunun anlamı insan vücudu virüs.

Olumlu bir sonuç, kendi kendine tedavi için bir neden olmamalıdır, çünkü her hasta kendi hastalık resmine sahip olabilir.

Kalitatif analiz, tarama ve belgelendirmeyi içerir. Hastada virüs yoksa sonuç “negatif”. Bu sertifika bulunduğunda ek tarama testleri yapılır. Taramayı onaylayan veya reddeden immünoblot analizi. Test şeritlerinde belirli bölgelerin koyulaşması (protein yerleşimi) görülüyorsa tanı “HIV”dir.

Sonuçlar şüpheli ise, testler üç ay içinde gerçekleştirilir.

İnsan immün yetmezlik virüsü ile enfeksiyonu önlemek için, belirli kurallara uymanız mümkündür: gündelik cinsel temastan kaçının, temas sırasında prezervatif kullanın, uyuşturucu kullanmayın.

Hamile bir kadında hastalık tespit edilirse, doktorun tavsiyelerine uymak önemlidir, virüs varlığına yönelik testleri unutmayınız.

Western Blot nedir?

Çeşitli dokuların kompleks karışımlarında veya ekstraktlarında protein tanımlaması sıklıkla karşılaşılan sorunlardan biridir. Spesifik antikorlar gibi bir aracı kullanarak, incelenen proteini minimum zaman ve finansal maliyetle belirlemek mümkündür.

Western blot yönteminde, ilk aşamada, bir protein karışımı, sodyum dodesil sülfat (SDS) varlığında elektroforez ile ayrılır, ardından elektroblotlama ile bir nitroselüloz membrana aktarılır.

Bu yöntemin özü, elektroforezden sonra jelin, filtre kağıdı katmanları arasında bir nitroselüloz zar üzerine yerleştirilmesi gerçeğinde yatmaktadır. Bu şekilde bir araya getirilen "sandviç", protein-SDS komplekslerinin jel plakası boyunca hareket etmesi ve nitroselüloz zarın yüzeyi üzerinde (spesifik olmayan soğurmanın bir sonucu olarak) sabitlenmesi için bir elektrik alanına yerleştirilir.

Protein-SDS kompleksinin nitroselüloz membrana bağlanmasında esas olarak elektriksel kuvvetler yer alır ve bu etkileşim çok noktalıdır ve proteinlerin membran yüzeyinde "yayılmasına" yol açar. Böylece, elektrotransferden sonra, poliakrilamid jeldeki ile aynı şekilde düzenlenmiş proteinlerle nitroselüloz üzerindeki jelin bir kopyasını elde ederiz.

SDS'den sonra - elektroforez, elektrotransfer ve proteinlerin jelden bir nitroselüloz membrana emilmesi, proteinin üçüncül yapısı büyük ölçüde değişir, eğer bu kadar sert bir işlemden sonra protein için üçüncül bir yapının varlığından bahsetmek genel olarak doğruysa . Bu nedenle, incelenen proteinin immünokimyasal tespiti için, genellikle protein molekülünün lineer bölgelerine özgü mono- veya poliklonal antikorlar kullanılır.

51. Enzim imünolojik tahlili, imünoblotlama. Mekanizma, bileşenler, uygulama.

Konformasyonel epitoplara (veya alt birimler arası temasları içeren bölgelere) özgü antikorlar, genellikle Western blot yönteminde kullanım için uygun değildir.

Protein transferinden sonra, zar sırayla incelenen proteine özgü antikorlarla ve daha sonra bir enzim (veya başka bir) etiketiyle konjuge edilmiş birincil antikorların Fc fragmanlarına özgü ikincil antikorlarla inkübe edilir (Şekil 1).

1 A). Çalışılan antijene özgü birincil antikorların doğrudan etiketle konjuge edilmesi durumunda, ikincil antikorlara gerek yoktur (Şekil 1 B). Çalışılan protein lokalizasyonunun yerinde oluşan bağışıklık kompleksleri, kromojenik bir substratın yardımıyla (etiket tipine bağlı olarak) "tezahür eder".

Yöntemin duyarlılığı ve özgüllüğü büyük ölçüde çalışmada hangi antikorların kullanıldığına bağlıdır.

Kullanılan antikorlar, yalnızca çalışılan proteine özgü benzersiz bir amino asit dizisine özgü olmalıdır. Aksi takdirde, antikorların birkaç protein molekülü ile etkileşimi (özellikle kaba protein ekstraktları durumunda) mümkündür ve bu da zar üzerinde birkaç renkli bandın görünmesine yol açacaktır.

Bu durumda incelenmekte olan proteinin tanımlanması genellikle zordur ve hatta imkansızdır.

Antikorları seçerken akılda tutulması gereken ikinci önemli faktör afinitedir. Kullanılan antikorların afinitesi ne kadar yüksek, protein bantları ne kadar parlak ve net lekeleniyorsa, yöntemin hassasiyeti o kadar yüksektir. Yüksek afiniteli antikorlar kullanıldığında 1 ng ve hatta daha yüksek hassasiyet elde edilebilir.

Membrana bağlı antijen ve antikorların etkileşiminin sonucunu görselleştirmek için, belirli koşullar altında belirli bir sinyal verebilen ajanlarla konjuge sekonder antikorlar kullanılır.

Genellikle, bu tür bir ajan olarak, reaksiyon ürünü bir renge sahip olan ve çözünmeyen bir çökelti şeklinde zar üzerinde çökelen bir enzim (peroksidaz veya fosfataz) kullanılır.

Ayrıca Bu method Floresan etiketler kullanılabilir.

Pirinç. 1. Çalışılan proteinin immünokimyasal boyama şeması: A - bir enzim etiketi ile konjüge edilmiş ikincil antikorlar kullanılarak; B - birincil antikor doğrudan bir enzim etiketi ile konjuge edilir.

Protokol:

I. Jel ve membran hazırlama ve protein elektrotransferi

Elektroforezden sonra poliakrilamid jel, kurutma tamponu (25 mM Tris, pH 8.3, 192 mM glisin, %10 etanol) içeren bir banyoya yerleştirildi.

Blot kaseti şeklinde kesilmiş ve blotting tamponu ile nemlendirilmiş iki yaprak filtre kağıdı, kasetin anoda bakan kısmına yerleştirilir. Daha sonra aynı tamponla önceden nemlendirilmiş nitroselüloz membran filtre kağıdının üzerine yerleştirilir ve membran ile kağıt arasında hava kabarcığı kalmadığından emin olunur.

Bundan sonra jel dikkatli bir şekilde membran üzerine yerleştirilmeli ve tekrar döndürülmelidir. Özel dikkat Jel ve membran arasında hava kabarcığı olmaması için. Sandviç, jelin yüzeyine yerleştirilmiş iki kat ıslatılmış filtre kağıdı ile tamamlanır (Şekil 2). Ortaya çıkan sandviç kasete sıkıştırılır ve membran anoda bakacak şekilde elektrotların arasına yerleştirilir.

Pirinç. 2. Proteinlerin zara elektrotransfer şeması.

II. elektrotransfer

Proteinlerin bir nitroselüloz membrana elektrotransferi, 25 mM Tris, pH 8.3, 192 mM glisin, %10 etanol içeren bir tampon içinde 30-50 dakika boyunca 100 V sabit voltajda gerçekleştirilir.

Elektrotransfer süresi, transfer edilen proteinlerin boyutuna bağlıdır, protein ne kadar büyükse, elektrotransfer o kadar uzun sürer. Elektrotransportun kalitesi ve protein bantlarının düzenlenmesi, nitroselüloz zarın %1'lik Ponceau S'nin %0,3'lük bir çözeltisiyle boyanmasıyla değerlendirilir. asetik asit. İmmün boyamadan önce, proteine bağlı boyayı uzaklaştırmak için membran hafif alkali sulu Tris solüsyonu ile birkaç kez yıkanmalıdır.

III. Bir nitroselüloz zar üzerinde immobilize edilmiş proteinlerin immünokimyasal boyanması

Spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke etmek için, membran oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sürekli karıştırılarak PBST içinde inkübe edilir (daha iyi bloke etmek için %10 yağsız süt tozu içeren bir PBST solüsyonu kullanılabilir).

Bloklamadan sonra zar, 1-10 ug/ml spesifik antikorlar içeren PBST içinde sürekli karıştırılarak oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edilir.

Optimal antikor konsantrasyonu ampirik olarak seçilir ve antikorların antijen ile etkileşiminin afinitesine bağlıdır.

İnkübasyonun sonunda zar, 5 kez PBST ile yıkandı ve yaban turpu peroksidaz ile konjüge edilmiş ikincil antikorların bir çözeltisine aktarıldı. Konjugatın seyreltilmesi genellikle üretici tarafından ambalaj üzerinde belirtilir veya araştırmacı tarafından ampirik olarak seçilir. Membranı, sürekli karıştırarak 1 saat boyunca bir ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin.

İyice yıkandıktan sonra (en az 5-6 tampon değişikliği), PBST membranı, 10 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6 içinde 3 mg diaminobenzidin (DAB) ve 10 ul %30 hidrojen peroksit içeren kromojenik bir substrat çözeltisine aktarılır. .

İnkübasyon 5 ila 10 dakika karıştırılarak gerçekleştirilir. Substrat ile inkübasyonun sona ermesinden sonra, membran PBST ile yıkanmalı, filtre kağıdı ile lekelenerek kurutulmalı ve hemen renkli tarama ile elektronik bir kopya yapılmalıdır. Zar tamamen kurursa, boyalı protein şeritleri solar ve görüntü daha az parlak ve kontrastlı olur.

Not: DAB toksiktir ve potansiyel bir kanserojendir. Sadece lastik eldivenlerle çalışın!