Ensüüm peroksidaas on lihas mitteaktiivne. Liha biokeemilised uuringud

Meetod põhineb peroksidaasi ensüümi võimel osaleda vesinikperoksiidi oksüdatsiooni protsessides hapniku arvelt. Peroksidaasi olemasolu määratakse guajakooli, bensidiini, amidopüriini (püramidooni) reaktsioonide abil. 80 °C juures inaktiveeritakse peroksidaas. Seega, kui uuritavas artiklis tuvastatakse peroksidaas, peetakse kuumtöötlust ebapiisavaks.

Seadmed, materjalid, reaktiivid. Kaalud on laboratoorsed; keemilised katseklaasid läbimõõduga 15 mm; korgikorgid; katseklaaside alus; portselanmört läbimõõduga 7–9 cm; tilgutajad; liivakell 1, 2 minutit; klaaslehtrid läbimõõduga 4–5 cm; pipetid mahuga 1 ja 20 cm 3; koonilised kolvid mahuga 50 ja 100 cm 3; filterpaber; vatt; guajakool, alkoholilahus massifraktsiooniga 1% (100 cm 3 mõõtekolvis lahustatakse 1 g guajakooli etüülalkoholiga); bensidiin, alkoholilahus massifraktsiooniga 0,02% (20 mg bensidiini lahustatakse 100 cm 3 etüülalkoholis); amidopüriin, alkoholilahus massifraktsiooniga 2% (2 g amidopüriini lahustatakse 98 cm 3 etüülalkoholis); etanool; vesinikperoksiid (30–35%), lahus massiosaga 10%; jää-äädikhape; veevaba naatriumatsetaat; destilleeritud vesi.

Testi läbiviimine. Peroksidaasi redoks-omadused avalduvad rangelt määratletud pH vahemikus. Kõige intensiivsem värvus on täheldatud pH väärtuste vahemikus 4,4 kuni 6,9; vähem intensiivne pH 3,4 ja kõrgemal; ei paista üle pH 10,4.

Analüüsis kasutatakse atsetaatpuhverlahust, mille pH on 4,9.

Praetud toote seest võetud purustatud proov koguses 10 g ja kaalutud 0,01 g täpsusega, jahvatatakse uhmris 20 cm 3 destilleeritud veega ja filtreeritakse läbi paberfiltri või vatikihi. koonilisse kolbi. Seejärel viiakse 0,5 cm 3 filtraati katseklaasi, lisatakse 0,5 cm 3 atsetaatpuhvrit, 0,5 cm 3 guajakooli alkoholilahust, 0,25 cm 3 värskelt valmistatud vesinikperoksiidi lahust ja loksutatakse. Lihatoote piisava kuumtöötlemise korral jääb lahus värvitu, ebapiisava, sõltuvalt säilitatava peroksidaasi kogusest, värvus võib olla helesinisest tumesiniseni ja ilmub 1 minuti jooksul.

Bensidiini alkoholilahuse või amidopüriini alkoholilahuse kasutamisel võetakse katseklaasi 1 cm 3 filtraati, lisatakse 1 cm 3 ühte neist lahustest, samuti 0,5 cm 3 vesinikperoksiidi lahust ja raputatud. Peroksidaasi juuresolekul 1 min. ilmub vastavalt sinakasroheline või sinakasvioletne värv. Piisava kuumtöötluse korral värvimuutust ei toimu.

Arvestades, et haigete loomade lihas ja vananenud lihas on peroksidaasi ensüüm inaktiveeritud, on kulinaariatoodete kuumtöötlemise kvaliteedi lõplikuks otsustamiseks vaja kontrollida peroksidaasi olemasolu liha pooltoodetes. . Peroksidaasi puudumisel pooltootes määratakse kuumtöötluse piisavus fosfataasi testiga.

Fosfataasi test

kvaliteetne vastus. Meetod põhineb fosfataasi ensüümi võimel lõhustada paranitrofenüülfosfaadi baariumisoola temperatuuril 38 °C, vabastades paranitrofenooli, mis muudab keskmise kollaseks.

Kaalud on laboratoorsed; elektripliit; veevann; portselanmört läbimõõduga 7-9 cm; silinder mahuga 1 cm 3; jaotuslehter mahuga 250 cm 3; korgikorgid; tilguti; klaaslehtrid läbimõõduga 4-5 cm; marli; filterpaber; klaasvill; paranitrofosfaadi baariumisool, küllastunud lahus; naatriumhüdroksiid, lahus massikontsentratsiooniga 400 g / dm 3 (D \u003d 1,43 g / cu. cm); magneesiumkloriid, lahus massikontsentratsiooniga 5 g/dm 3; atsetaatpuhver pH 5,4; destilleeritud vesi.

Testi läbiviimine. Purustatud proov, mis on võetud toote sisemusest koguses 20 g ja kaalutud 0,01 g täpsusega, viiakse uhmrisse ja jahvatatakse, lisades järk-järgult 50 cm 3 destilleeritud vett. Saadud suspensioon filtreeritakse läbi kahekordse marlikihi ja marli jäänud proov pressitakse välja, seejärel filtreeritakse ekstrakt läbi kuiva volditud filtri ja jagatakse pooleks. Ühte osa (filtraat 1) uuritakse otse, teine ​​(filtraat 2) viiakse koonilisse kolbi, keedetakse ja filtreeritakse uuesti - see osa filtraadist on kontroll.

Fosfataasi aktiivsuse kontrollimiseks mõõdetakse katseklaasis 1 cm 3 filtraati 1, 2 tilka magneesiumkloriidi lahust massikontsentratsiooniga 5 g / dm 3, 2 tilka atsetaatpuhvrit (pH 5,4) ja 0,5 Lisatakse cm3 paranitrofenüülfosfaadi baariumisoola lahust.

Kontrolliks mõõdetakse teise katseklaasi 1 cm 3 filtraati 2 ja lisatakse samad reaktiivid, mis esimeses. Mõlemad katseklaasid asetatakse 1 tunniks veevanni või termostaadi temperatuurile 37-38 °C. Seejärel lisatakse mõlemasse katseklaasi tilkhaaval naatriumhüdroksiidi lahust.

Kulinaarse toote piisava kuumtöötluse korral ei muutu mõlema katseklaasi värvus. Ebapiisava kuumtöötluse korral muutub lahus kollaseks.

Happelise fosfataasi jääkaktiivsuse määramine (kvantifitseerimine). Meetod põhineb tootes tekkiva värvuse intensiivsuse fotomeetrilisel määramisel, mis sõltub happelise fosfataasi jääkaktiivsusest, väljendatuna fenooli massifraktsioonina.

Seadmed, materjalid, reaktiivid. Kaalud on laboratoorsed; mõõteveaga potentsiomeeter ± 0,06 pH; fotoelektriline kolorimeeter või spektrofotomeeter mõõtmiseks spektri nähtavas piirkonnas; ultratermostaat või veevann; lehtrid; mõõtekolvid mahuga 500 ja 1000 cm 3; pipetid gradueeritud 1-ni; 5; 10 cm 3; klaaspulgad; katseklaasid; filterpaber; kummist pirn; sidrunhape; naatriumtsitraat 5-vesi; fenüülfosforhappe dinaatriumsool, lahus massikontsentratsiooniga 2 g/dm3, värskelt valmistatud; trikloroäädikhape, kristalne, lahused massikontsentratsiooniga 50 ja 200 g/dm 3; naatriumhüdroksiid, lahus C (NaOH) \u003d 0,5 mol / dm 3; destilleeritud vesi; fenool; tolueen; naatriumvolframaat; liitiumsulfaat 1-vesi; ortofosforhape tihedusega 1,72 g/cm 3; vesinikkloriidhape tihedusega 1,19 g / cm 3; broomi.

Testiks valmistumine. Atsetaatpuhver: 1000 cm 3 mahuga mõõtekolvis lahustada destilleeritud vees 13,88 g naatriumtsitraati ja 0,588 g sidrunhapet, lisada vett märgini ja segada, puhverdada pH 6,5. Seejärel lisage 1 cm 3 tolueeni. Lahust hoitakse külmkapis temperatuuril 4 ± 1 °C mitte rohkem kui 12 päeva.

Folini reaktiiv: 100 g naatriumvolfraati ja 25 g naatriummolübdaati lahustatakse 700 cm 3 destilleeritud vees. Lahusele lisatakse 50 cm 3 fosforhapet ja 100 cm 3 vesinikkloriidhapet. Segu keedetakse ettevaatlikult 10 tundi 2000 cm3 kolvis, seejärel jahutatakse ja lisatakse 150 g liitiumsulfaati, 50 cm 3 vett ja mõned tilgad broomi. Ülejäänud broom destilleeritakse, keetes segu ilma külmkapita tõmbekapis, jahutatakse, viiakse mõõtekolbi mahuga 1000 cm 3, maht reguleeritakse destilleeritud veega märgini, segatakse ja filtreeritakse. Reaktiiv peaks olema kuldne kollast värvi rohelist tooni pole seda hoitakse jahvatatud korgiga pudelis pimedas kohas mitte rohkem kui 6 kuud.

Standardne lahendus: 2 g fenooli (kaaluga 0,001 g täpsusega) lahustatakse vees 1000 cm 3 mahuga mõõtekolvis, maht reguleeritakse märgini ja segatakse. Pipeteerige 5 cm 3 lahust kummist pirniga 500 cm 3 mahutavusega kolbi, lisage umbes 300 cm 3 destilleeritud vett, lisage 25 g kristallilist trikloroäädikhapet. Pärast lahustumist lisati kolvi sisu destilleeritud veega märgini ja segati. Saadud lahus sisaldab 20 µg fenooli 1 cm 3 kohta.

Kalibreerimisgraafiku koostamine. Katseklaasidesse lisatakse järgmised kogused standardlahust: 0; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 cm 3, mis vastab fenooli massile: 0; 5; kümme; kakskümmend; kolmkümmend; 40 mcg. Viige iga katseklaasi maht 2,5 cm 3-ni, lisades sobivas mahus trikloroäädikhappe lahust massikontsentratsiooniga 50 g/dm 3 (2,5; 2,25; 2,0; 1,5; 1,0; 0,5 cm 3 ) ja segage. Lisage igasse katsutisse 5 cm 3 naatriumhüdroksiidi lahust, segage, inkubeerige 10 minutit, lisage 1,5 cm 3 destilleeritud veega lahjendatud Folini reaktiivi vahekorras 1:2 ja segage.

Pärast 30 min. mõõta lahuste optiline tihedus trikloroäädikhappe lahuse suhtes massikontsentratsiooniga 50 g/dm 3 fotoelektrokolorimeetril, kasutades valgusfiltrit lainepikkusega 600 ± 10 nm küvetis tööpindade vahekaugusega. 10 mm või spektrofotomeeter lainepikkusel 600 nm sama suurusega küvetis.

Kolme standardlahuse kohta saadud keskmiste andmete põhjal koostatakse 20x20 cm suurusele millimeetrisele paberile kalibreerimisgraafik. Abstsissteljele kantakse fenooli massiosa väärtus (mikrogrammid 9 cm 3 värvilises lahuses); y-teljel - vastava optilise tiheduse (D) väärtus. Kalibreerimiskõver peab läbima alguspunkti.

Testi läbiviimine. Testimiseks ettevalmistatud kombineeritud proovist võetakse 2 portsjonit kaaluga 1 g (täpsusega 0,001 g) ja kantakse kahte katseklaasi (kontroll- ja katseklaasi).

Katseklaasidesse lisatakse 10 cm 3 atsetaatpuhvrit pH 6,5, segatakse põhjalikult klaaspulgaga ja infundeeritakse 20 minutit. 20°C juures, aeg-ajalt segades.

Lisage kontrollkatseklaasi 5 cm 3 (200 g/dm 3) trikloroäädikhappe lahust, segage ja lisage 5 cm 3 (2 g/dm 3) fenüülfosforhappe dinaatriumsoola lahust, inkubeerige 10 minutit ja filtreerige.

Katseklaasi lisatakse 5 cm 3 (2 g / dm 3) fenüülfosforhappe dinaatriumsoola lahust ja asetatakse 1 tunniks termostaadi temperatuurile 39 ± 1 ° C, seejärel 5 cm 3 200-st. Lisatakse g/dm3 trikloroäädikhappe lahust ja inkubeeritakse 10 minutit. ja filtreerida.

Värvusreaktsiooni läbiviimiseks võetakse kontroll- ja katseklaasist 2,5 cm 3 valguvaba filtraati. Värvireaktsioon viiakse läbi vastavalt ülalkirjeldatud meetodile.

Fenooli mass proovis määratakse kalibreerimiskõvera järgi.

Tulemuste töötlemine. Fenooli massiosa (X, %) arvutatakse järgmise valemiga:

m 1 - fenooli mass katseklaasis, leitud

kalibreerimiskõver, μg;

m 2 - fenooli mass kontrolltorus, leitud

kalibreerimiskõver, μg;

m on analüüsitud proovi mass, g;

10 - teisendustegur;

20 - aretus;

2,5 - värvusreaktsiooni jaoks valitud filtraadi maht,

Arvutus viiakse läbi kuni 0,0001.

Lõpliku katsetulemuse saamiseks võetakse kahe paralleelse määramise tulemuste aritmeetiline keskmine, mille lubatud lahknevus P = 0,95 juures ei tohiks ületada 10% aritmeetilise keskmise suhtes.

Lõpptulemuseks määratakse 0,001.

Töö tulemuste analüüs: teha järeldusi sulfiteerimise mõjust redoksprotsesside aktiivsusele, võrrelda katalaasi aktiivsust erinevates proovides.

testi küsimused

1. Mis on ensüümid?

2. Millised omadused on ensüümidel?

3. Millised tegurid mõjutavad ensüümide aktiivsust?

4. Mis põhimõttel on ensüümide klassifitseerimine aluseks? Mitut ensüümiklassi nende klassifikatsioon sisaldab?

5. Milline on redoksensüümide roll?

6. Milline on dehüdrogenaaside ehitus ja toimemehhanism?

7. Milline on polüfenooloksüdaasi struktuur ja toimemehhanism?

8. Milline on askorbaatoksüdaasi struktuur ja toimemehhanism?

9. Milline on lipoksügenaasi struktuur ja toimemehhanism?

10. Milline on peroksidaasi struktuur ja toimemehhanism?

11. Milline on katalaasi struktuur ja toimemehhanism?

12. Milline on katalaasi roll toidutehnoloogiates ja raku eluprotsessides?

13. Kuidas määrata katalaasi aktiivsust?

Ülesanded teemale

1. Mis omadus on ensüümidel?

a) Tegevuse eripära.

b) Võimalus süsteemis tasakaalu nihutada.

c) Termiline stabiilsus.

d) Tegevuse universaalsus.

2. Milline aminohapetest sisaldub kõige sagedamini ensüümi aktiivses keskuses?

a) seriin, b) glütsiin, c) valiin, d) metioniin.

3. Milleks on ette nähtud ensüümi katalüütiline kese?

a) Koensüümi kinnitumine.

b) Substraadi teisendus.

c) Efektorite ühendamine.

4. Millise klassi ensüümid kiirendavad vees toimuvaid lagunemisreaktsioone?

a) oksüdoreduktaasid, b) transferaasid, c) hüdrolaasid, d) lüaasid.

5. Milliseid reaktsioone kiirendavad ligaaside klassi ensüümid?

a) Orgaaniliste molekulide mittehüdrolüütiline lagunemine.

c) Sünteesireaktsioonid.

6. Mis on koensüüm?

b) Mittevalguline, kergesti eraldatav katalüüsis osalevast ensüümainest.

c) Inaktiivne ensüümi prekursor.

d) Ensüümi aktivaator.

7. Mis on kontaktala eesmärk?

a) Koensüümi kinnitumine.

b) Substraadi teisendus.

c) Efektorite ühendamine.

d) Substraadi kinnitus ja orientatsioon.

8. Mis on isoensüümid?

a) Ensüümid, mis katalüüsivad isomerisatsioonireaktsioone.

b) denatureeritud ensüümid.

c) Ensüümid, millel on erinev kvaternaarne struktuur, kuid mis katalüüsivad sama reaktsiooni.

d) Ensüümid, millel on sama üldvalem, kuid erinev struktuur.

9. Milliseid reaktsioone kiirendavad lüaasiklassi ensüümid?

a) Mittehüdrolüütiline lagunemine ja süntees kaksiksidemete moodustumisega.

b) Funktsionaalsete rühmade ülekandereaktsioonid.

c) Isomerisatsioonireaktsioonid.

d) Redoksreaktsioonid.

10. Mis on proteesirühm?

a) Substraadiga seotud ensüüm.

b) Ensümomolekuli mittevalguline osa, sellest kergesti eraldatav.

c) Molekuli mittevalguline osa, mis on kindlalt seotud apoensüümiga.

d) Ühe vitamiini fragment.

kontrolli ennast

1. Ensüümi katalüütiliste ja substraattsentrite kogumit nimetatakse:

a) apoensüüm, b) ensüümi aktiivne sait, c) allosteeriline sait.

2. Katalüüsi eest vastutava kompleksse ensüümi mittevalgulist osa nimetatakse:

a) koensüüm, b) kofaktor, c) apoensüüm.

3. Tsütoplasmas paiknevad rakulised ensüümid maksimaalne aktiivsus pH tasemel, mis on lähedane:

a) 7, b) 2-3, c) 4-5, d) 9-10.

4. Koensüümi koostis sisaldab vitamiini:

a) A, b) B 6, c) B 2, d) K.

5. Ensüümid, mis katalüüsivad bioloogiliste molekulide sünteesi ATP osalusel, kuuluvad klassi:

a) transferaasid, b) ligaasid, c) hüdrolaasid, d) lüaasid, e) isomeraasid.

Reaktsiooni olemus seisneb selles, et lihas paiknev peroksidaas ensüüm lagundab vesinikperoksiidi koos hapniku moodustumisega, mis oksüdeerib bensidiini. Sel juhul moodustub parakinoondiimiid, mis annab alaoksüdeeritud bensidiiniga sinakasrohelise ühendi (parakinoondiimiid), mis muutub pruuniks.

Selle reaktsiooni ajal tähtsust omab peroksidaasi aktiivsust. Tervete loomade lihas on see väga aktiivne, haigete ja agoonias hukkunute lihas on selle aktiivsus oluliselt vähenenud.

Peroksidaas + bensidiin + 2H 2 O 2 + bensidiin

parakinoondiimiid (sinakasroheline värvus, muutub pruunikaspruuniks).

Definitsiooni tehnika. 2 ml lihaekstrakti valatakse katseklaasi vahekorras 1:4 (valmistatud pH määramiseks kolorimeetrilise meetodiga), lisatakse 5 tilka 0,2% bensidiini lahust, loksutatakse ja 2 tilka 1% vesinikperoksiidi. lisatakse lahus.

Tulemuste hindamine. Kell Pärast positiivset reaktsiooni omandab lihaekstrakt 0,5 - 1,5 minutiga sinakasrohelise värvuse, mis muutub kiiresti pruunikaspruuniks. See reaktsioon on iseloomulik tervelt loomalt saadud lihale.

Nõrgalt positiivne reaktsioon (kahtlane). Ületöötanud, vanade ja haigete loomade lihast saadud ekstrakt omandab sinakasrohelise värvuse, mis hilinemisega muutub pruunikaspruuniks.

Negatiivne reaktsioon. Raskesti haigete või piina all olevate loomade lihast saadud ekstraktis ei ilmne sinakasrohelist värvi ja ekstrakt omandab koheselt pruunika varjundi.

6.5 Formooli reaktsioon (vastavalt G. V. Kolobolotsky ja E. V. Kiselevi järgi)

Raskete haiguste korral kogunevad isegi looma eluea jooksul lihastesse märkimisväärses koguses valkude metabolismi vahe- ja lõppprodukte - polüpeptiide, peptiide, aminohappeid jne. Selle reaktsiooni olemus on nende ainevahetusproduktide sadestumine. formaldehüüdiga.

Definitsiooni tehnika. Reaktsiooni käivitamiseks on vaja katselihast saadud vesiekstrakti vahekorras 1:1. 1:1 ekstrakti valmistamiseks vabastatakse lihaproov rasvast ja sidekoest ning kaalutakse 10 g. Seejärel asetatakse proov uhmrisse, purustatakse ettevaatlikult kõverate kääridega, lisatakse 10 ml soolalahust ja 10 tilka 0,1 N naatriumhüdroksiidi. lisatakse lahus.

Liha hõõrutakse nuiaga. Saadud suspensioon viiakse klaaspulgaga kolbi ja kuumutatakse valkude sadestamiseks keemiseni. Kolb jahutatakse külm vesi kraani all, mille järel selle sisu neutraliseeritakse viie tilga 5% oblikhappe lahuse lisamisega ja juhitakse läbi filterpaberi katseklaasi. Kui ekstrakt jääb pärast filtreerimist häguseks, filtreerige teist korda või tsentrifuugige.

Kaubanduslikult toodetud formaliinil on happeline keskkond, seetõttu neutraliseeritakse see eelnevalt 0,1 N naatriumhüdroksiidiga indikaatori järgi, mis koosneb neutraalse 0,2% vesilahuste ja metüleensinise võrdsest segust, kuni värvus muutub lillast roheliseks.

Reaktsiooni jaoks valatakse katseklaasi 2 ml ekstrakti ja 1 ml neutraalne formaliin.

Tulemuste hindamine. Positiivne reaktsioon. Agoonias tapetud, raskelt haige või pärast surma tapetud looma lihast saadud ekstrakt muutub tihedaks trombiks.

Kahtlane vastus. Väsinud või haige looma lihast saadud ekstraktis pudenevad helbed välja.

Negatiivne reaktsioon. Terve looma lihast saadud ekstrakt jääb läbipaistvaks või kergelt häguseks.

Liha loetakse saadud tervelt loomalt, kui rümba organoleptilised omadused on head, patogeensed mikroobid puuduvad, pH 5,7–6,2, positiivne reaktsioon peroksidaasile ja negatiivne formoolreaktsioon. Patsiendi, aga ka ületöötanud looma liha ei ole piisavalt veritsetud, pH 6,3 - 6,5, reaktsioon peroksidaasile on negatiivne ja formooli test positiivne (helbed). Agoonias tapetud looma liha on halvasti veretunud, sinaka või lillakasroosa värvusega lümfisõlmed, pH 6,6 ja üle selle, on reaktsioon peroksidaasile negatiivne ja formooli reaktsiooniga kaasneb tarretisesarnase trombi moodustumine.

Tabel 2 Tervete ja haigete loomade liha laboratoorsed näitajad

Vesinikperoksiidi ja peroksidaasi juuresolekul moodustab bensidiin kahest molekulist keerukama ühendi, mis on värvitud siniseks. See laguneb järk-järgult pruuni aine moodustumisega.

Bensidiini reaktsiooni puuduseks on selle difuussus. Selle kõrvaldamiseks lisatakse reagendile ammooniummolübdaati, mis sadestab värvilise aine.

Reaktiivid

1) 0,85% naatriumkloriidi lahus.

2) 0,1% ammooniummolübdaadi lahus peale soolalahus.

3) bensidiini küllastunud lahus soolalahuses.

4) 20% vesinikperoksiidi lahus.

5) Vesinikperoksiidi ja bensidiini segu kiirusega 1 tilk vesinikperoksiidi 2 ml bensidiini kohta (enne kasutamist segada).

Reaktsiooni läbiviimine

1. Asetage sektsioonid 3 minutiks kellaklaasi 0,85% keedusoola lahusesse temperatuuril 4°C.

2. Töödelge lõike 0,1% ammooniummolübdaadiga soolalahuses 5 minutit.

3. Töödelge lõike bensidiini lahusega, mis on enne kasutamist segatud vesinikperoksiidiga, 5 minutit (kuni ilmub sinine värvus).

4. Loputage sektsioone värske jahutatud soolalahusega.

5. Jälgige sinise värvi lokaliseerimist.

Reaktsiooni tulemused (tabelid 28, 29)

Kapsalehes sadestuvad sinised kristallid kohtadesse, kus aktiivne peroksidaas koguneb. Reaktsioon kulgeb lehe kõigis kudedes märgatava intensiivsusega, enam-vähem ühtlaselt kogu parenhüümi ulatuses. Kimpudes on floeemiosa eriti intensiivselt määrdunud. Kambium plekib palju nõrgemalt. Peroksidaasi rohkus floemis on ilmselt seletatav asjaoluga, et läbi rakkude liikuvad plastilised ained läbivad osalise oksüdatsiooni ja kulutatakse kambiumi poolt moodustatud uute rakkude ainete sünteesiks.

Maisiterades kulgeb reaktsioon ebaolulise intensiivsusega. Embrüos on värvus peaaegu sama nõrk kui endospermis. Intensiivsem värv iseloomustab juhtivaid elemente. Reaktsiooni andvate rakkude tsütoplasma värvumine on ebaühtlane, plastiidid värvuvad palju tugevamalt kui tsütoplasma.

Peroksidaasi reaktsiooni põhimõte Graham-Knolli meetodil. Rakuperoksüdaasid lagundavad vesinikperoksiidi; nii vabanev hapnik oksüdeerib bensidiini. Viimane ilmub peroksidaas-positiivse granulaarsuse tasemel kollakaspruuni sadena.

Peroksidaasi reaktiivid:
1) Fikseerija: veinialkohol 96 ° (9 osa) + 40% formaliini (1 osa).

2) Bensidiini alkoholilahus vesinikperoksiidiga, mis sisaldab: mõnda bensidiini kristalli, 10 ml 40° alkoholi ja 0,02 ml 3% vesinikperoksiidi.
Pärast bensidiini lahustamist alkoholis filtreerige lahus ja lisage 0,02 ml-ni gradueeritud hemoglobiinipipetti kasutades vesinikperoksiidi.

3) 10% lahjendatud Giemsa lahus.

Peroksiidi reaktsiooni tehnika

Ankurdamine määrib alkoholi-formaliini segus, 30 sek.; destilleeritud veega pesemine; värvimine bensidiini ja vesinikperoksiidi lahusega - 5 min; destilleeritud veega pesemine; kontrastvärvimine lahjendatud Giemsa lahusega - 25 min; Lõpuks loputage jooksva veega.
Soovitatav töötage ainult värskelt valmistatud määrdumisega.

Peroksiidi reaktsiooni tulemused. Kollakaspruun granulaarsus näitab raku peroksidaasi aktiivsuse olemasolu. Reaktsioon on positiivne normaalse granulotsüütide seeria rakkudes, alustades promüelotsüüdist. Müeloblast sisaldab peroksidaase, mis lähenevad promüelotsüüdile arenenumas staadiumis.

Lümfoidrakud negatiivne. Monotsüütide reaktsioon on negatiivne või kergelt positiivne.

Peroksiidi reaktsiooni praktiline tähtsus. Tsütoloogilise tüübi diferentseerumine: lümfoblastides negatiivne, müeloblastides aga erineva intensiivsusega ensüümide aktiivsus. Aueri kehad on peroksiid-dazopositiivsed. Meetodi tähtsus on piiratud: positiivne reaktsioon kujutab endast väärtuslikku teavet, samas kui negatiivne ei ole veenev; tulemust tuleks võrrelda teiste tsütokeemiliste uuringutega.

Mõne raske infektsiooniga, krooniline müeloproliferatsioonid, samuti mõnede müelodüsplastiliste nihete (pre-leukeemiline seisund) protsessis täheldatakse küpsetes neutrofiilsetes granulotsüütides osaliselt või täielikult peroksüdaas-negatiivseid tsoone. Need muutused koos peroksidaasi sarnase käitumisega on väärtuslikud leukeemiaeelse seisundi varajaseks diagnoosimiseks.

Reaktsiooni olemus.

See seisneb selles, et lihas leiduv ensüüm peroksidaas lagundab vesinikperoksiidi hapniku moodustumisega, mis oksüdeerib bensidiini. Sel juhul moodustub parakinoondiimiid, mis oksüdeerimata bensidiiniga annab sinakasrohelise värvi ühendi, mis muutub pruuniks. Selle reaktsiooni ajal on peroksüdaasi aktiivsus hädavajalik. Tervete loomade lihas on see väga aktiivne, haigete ja agoonias hukkunute lihas on selle aktiivsus oluliselt vähenenud.

Reaktsiooni tehnika.

Valage katseklaasi 2 ml ekstrakti (1:4), lisage 5 tilka bensidiini 0,2% alkoholilahust, loksutage ja lisage 2 tilka 1% vesinikperoksiidi lahust.

Sanitaarhindamine.

Soolvees.

Peroksidaasi reaktsiooni kasutatakse kui täiendav meetod uuringud, annab see selge tulemuse lahjendamata soolveega tardudes.

Hapukurk alates healoomuline soolaliha- värvitud sinakasrohelise värviga; soolatud veiseliha soolvees riknemise algstaadiumid- sinakasroheline värv ilmub pika viivitusega ja soolvees vana soolatud veiseliha - ei paista üldse. Soolveeproovide puhul täheldatakse positiivset reaktsiooni peroksidaasile pH tasemel kuni 6,4–6,5; soolvee pH väärtusel 6,6 on reaktsioon kaheldav ja pH 6,6 ja kõrgemal on see samuti negatiivne.

Soolaveiselihas.

väljavõte värske soolatud veiseliha- muutub sinakasroheliseks 1 minuti jooksul, kahtlastel juhtudel tekib kerge rohestumine 1-2 minuti jooksul ja muutub kohe pruuniks. Kapuutsi värv aegunud toit- ei muutu. Positiivne tulemus reaktsioone peroksidaasile leidub ekstraktides, mille pH on 6,4, pH 6,4 kuni 6,5 juures on reaktsioon nõrgalt positiivne ja üle 6,5 - negatiivne.

Kui putrefaktiivset riknemist ei esine, viitab negatiivne reaktsioon peroksüdaasile, et soolaliha valmistatakse haigete loomade lihast.

7. Valkude esmase lagunemise saaduste määramise meetod puljongis

Meetodi olemus. Meetod põhineb valkude sadestamisel kuumutamise teel, vasksulfaadi komplekside moodustumisel filtraadis valkude esmase lagunemise saadustega, mis sadestuvad.

Töö järjekord.

Kuum puljong filtreeritakse läbi filterpaberi katseklaasi, mis asetatakse klaasi külma vette. Kui pärast filtreerimist jäävad puljongisse valguhelbed, filtreeritakse puljong edasi. Valage 2 ml filtraati katseklaasi ja lisage 3 tilka 5% vasksulfaadi lahust. Raputage 2-3 korda ja asetage statiivile. 5 minuti pärast registreerige analüüsi tulemused.

Sanitaarhindamine.

Liha on värske- puljong jääb selgeks.

Kahtlase värskusega liha- puljong muutub häguseks

Liha on vananenud- puljongis langeb välja tarretisesarnane sade ja sulatatud lihast - suured helbed.

8. Ammoniaagi määramise meetod soolalihas Nesleri järgi

Meetodi olemus. Meetod põhineb ammoniaagi ja ammooniumisoolade võimel moodustada Nesleri reagendiga merkurammooniumjodiidi, kollakaspruuni värvi ainet.

Töö järjekord.

5 g kaaluv hakkliha portsjon viiakse 20 ml destilleeritud veega koonilisse kolbi ja infundeeritakse 15 minutit 3 korda loksutades. Saadud ekstrakt filtreeritakse.

Pipeteerige 1 ml ekstrakti katseklaasi ja lisage 10 tilka Nesleri lahust. Katsu sisu loksutatakse, jälgitakse värvimuutust ja seatakse ekstrakti läbipaistvus.

Sanitaarhindamine.

Soolatud veiseliha peetakse värskeks– kui ekstrakt omandab rohekaskollase värvuse, jääb läbipaistev või kergelt hägune.

Soolaveiseliha peetakse kahtlase värskusega- kui ekstrakt muutub intensiivselt kollaseks, muutub see oluliselt häguseks.

Soolaveiseliha peetakse aegunud– kui ekstrakt muutub kollakasoranžiks, tekivad kiiresti helbed ja sadestuvad.

9. Meetod soolatud veiselihas vesiniksulfiidi määramiseks

Töö järjekord.

Pange 15-20 g soolatud veisehakkliha lõdvalt laiasse katseklaasi. Filterpaberi ribale kantakse tilk 10% leeliselist pliatsetaadi lahust. Pabeririba kinnitatakse korgiga nii, et see ripub kuni katseklaasi keskele. Katseklaas asetatakse veevanni (50-55ºС) ja inkubeeritakse 15 minutit, paber eemaldatakse ja reaktsiooni loetakse.

Sanitaarhindamine.

Kui liha on värske- tilk ei ole määrdunud või muutub kergelt pruunikaks.

Kahtlase värskusega liha- tilk muutub pruunikaspruuniks.

Liha on vananenud- tumepruuni värviga.

10. Meetod soola määramiseks soolalihas Mohri meetodil.

Meetodi olemus. Meetod põhineb kloriidiooni tiitrimisel hõbeda iooniga neutraalses keskkonnas ja kaaliumkromaadi juuresolekul.

Töö järjekord.

5 g purustatud proovi kaalutakse keeduklaasi ja lisatakse 100 ml destilleeritud vett. Pärast 40-minutilist infusiooni filtreeritakse vesiekstrakt läbi paberfiltri. 5-10 ml filtraati pipeteeritakse koonilisse kolbi ja tiitritakse 0,05 N büretist. hõbenitraadi lahus 0,5 ml kaaliumkromaadi lahuse juuresolekul, kuni ilmub oranž värv.

Portsjon poolsuitsu, keedetud-suitsu, suitsuvorstid, soolapeekon, sea-, lamba- ja veiselihatooted (toorsuitsutatud, suitsutatud-keedetud, suitsutatud-küpsetatud, küpsetatud ja praetud) kuumutatakse klaasis veevannis temperatuurini 40ºС, hoitakse 45 minutit. ja filtreeriti läbi paberfiltri. Seejärel tiitrige nagu eespool.

Iseseisev töö: edusamme ACRE.

Harjutus. Selgitage liha lauasoolaga säilitamise olemust. Iseloomusta lühidalt soolamist kui üht iidsemat, laiemalt levinud ja ligipääsetavamat säilitusmeetodit.

Liha suursaadik - kunagi peeti seda peamiseks meetodiks. Külmutustehnoloogia arenguga hakati kasutama kõrged temperatuurid liha ja lihatoodete säilitamiseks, vorstitootmise arendamiseks andis suursaadik teed nendele säilitusmeetoditele. Kasutatakse peekoni, peekoni, suitsuliha tootmisel, vorstitootmisel abimeetodina.

Suursaadik viitab liha säilitamise keemilistele meetoditele. Selle olemus allub difusiooniseadusele, mis põhineb osmootsel difusiooniprotsessil. Soolamiseks kasutatakse soolvett - lauasoola vesilahust. Osmootse rõhu erinevuse tõttu liha koerakkudes ja soolvees, milles liha asub, toimub difusioon; sool ja muud koostisosad tungivad liha sisse ning vesi ja selles lahustuvad orgaanilised ühendid liiguvad lihast soolvette.

Konserveeritud veiseliha on võrreldes teiste liha säilitamisviisidega sitkem (koe dehüdratsiooni tõttu), sisaldab 6–12% soola, kaotab osa valke, fosfaate ja muid ekstraheerivaid aineid.