Viirusnakkuste laboratoorse diagnoosimise meetodid. Seroloogilised testid Diagnoosimiseks kasutatavad seroloogilised testid

Antigeen-antikeha reaktsioonil põhinevat seroloogilist diagnostikat saab kasutada mõlema määramiseks ja see mängib rolli viirusinfektsiooni etioloogia määramisel isegi viiruse eraldamise negatiivsete tulemuste korral.

Seroloogilise diagnoosimise edukus sõltub reaktsiooni spetsiifilisusest ja keha antikehade sünteesiks vajalike verevõtu ajutiste tingimuste järgimisest.

Enamasti kasutatakse paarisvereseerumit, mida võetakse 2-3 nädalaste intervallidega. Positiivseks reaktsiooniks loetakse antikehade tiitri vähemalt 4-kordset suurenemist. On teada, et enamik spetsiifilisi antikehi kuulub IgG ja IgM klassidesse, mis sünteesitakse nakkusprotsessi erinevatel aegadel. Kus IgM antikehad on varajased ning nende määramiseks kasutatud teste kasutatakse varajaseks diagnoosimiseks (piisab ühe seerumi uurimisest). IgG klassi antikehad sünteesitakse hiljem ja säilitatakse pikka aega.

Viiruse tüpiseerimiseks kasutatakse pH-d, rühmaspetsiifiliseks diagnostikaks, näiteks adenoviirusnakkuse korral, komplemendi sidumise reaktsioon(RSK). Enim kasutatud on hemaglutinatsiooni pärssimise reaktsioon(RTGA), RSK, RIF, passiivsed reaktsioonid ja vastupidine passiivne hemaglutinatsioon(RPGA, ROPGA), erinevad ELISA variandid, mis peaaegu kõikjal asendasid RIA-d, on selle suhtes võrdsed.

RTGA kasutatakse hemaglutineerivate viiruste põhjustatud haiguste diagnoosimiseks. See põhineb antikehade seondumisel lisatud standardviiruse patsiendi seerumiga. Reaktsiooni indikaatoriks on spetsiifiliste antikehade puudumisel viiruse poolt aglutineeritud erütrotsüüdid (iseloomuliku "vihmavarju" moodustumine) ja settivad põhja, nende juuresolekul aglutineerimata.

RSK on üks traditsioonilistest seroloogilistest testidest ja seda kasutatakse paljude diagnoosimiseks viirusnakkused. Reaktsioonis osalevad kaks süsteemi: patsiendi seerumi antikehad + standardviirus ja lamba erütrotsüüdid + nende vastased antikehad, samuti tiitritud komplement. Kui antikehad ja viirus kattuvad, seob see kompleks komplementi ja lamba erütrotsüütide lüüsi ei toimu ( positiivne reaktsioon). Negatiivse RSC korral aitab komplement kaasa erütrotsüütide lüüsile. Meetodi puuduseks on selle ebapiisavalt kõrge tundlikkus ja reaktiivide standardimise raskus.

RSK ja RTGA olulisuse arvessevõtmiseks on vaja tiitrida paarisseerumit, st võtta haiguse alguses ja taastumise ajal.

RPGA- viiruse antigeenide poolt sensibiliseeritud erütrotsüütide (või polüstüreenhelmeste) aglutinatsioon antikehade juuresolekul. Erütrotsüütidele saab sorbeerida mis tahes viirusi, olenemata nende hemaglutineeriva toime olemasolust või puudumisest. Mittespetsiifiliste reaktsioonide esinemise tõttu testitakse seerumeid lahjenduses 1:10 või rohkem.

RNGA- spetsiifiliste antikehade poolt sensibiliseeritud erütrotsüütide aglutinatsioon viiruse antigeenide juuresolekul. ROPHA sai HBs antigeeni tuvastamisel kõige suurema jaotuse nii patsientidel kui ka veredoonoritel.

KUI meetod samuti ELISA kasutatakse antikehade tuvastamiseks seerumis. ELISA diagnostilistel eesmärkidel muutub üha olulisemaks ja laialdasemaks. Viiruse antigeen sorbeeritakse tahkele faasile (polüstüreenplaatide või polüstüreenhelmeste süvendite põhja). Kui lisatakse seerumis olevad vastavad antikehad, seostuvad need adsorbeeritud antigeenidega. Soovitud antikehade olemasolu tuvastatakse ensüümiga (peroksüdaas) konjugeeritud antikehade (näiteks inimese) abil. Substraadi lisamine ja substraadi-ensüümi reaktsioon annavad värvi. ELISA-d saab kasutada ka antigeenide määramiseks. Sel juhul adsorbeeritakse antikehad tahkele faasile.

monoklonaalsed antikehad. Viirusnakkuste diagnoosimisel on tehtud suuri edusamme viimasel kümnendil, mil geenitehnoloogia uuringute arenedes töötati välja süsteem monoklonaalsete antikehade saamiseks. See suurendas dramaatiliselt spetsiifilisust ja tundlikkust diagnostilised meetodid viiruse antigeenide määramine. Monokloonide kitsas spetsiifilisus, mis esindavad väikest osa viirusvalkudest, mida kliinilises materjalis ei pruugi olla, on edukalt ületatud, kasutades mitmeid monoklonaalseid antikehi erinevate viirusdeterminantide vastu.

See põhineb viirusevastaste antikehade määramisel patsiendi veres seroloogilistes reaktsioonides, kasutades spetsiifilisi viirusantigeene - diagnostilisi või spetsiaalseid testimissüsteeme. Seroloogilised reaktsioonid viirusnakkuste korral asetatakse vedelasse söötmesse (RSK, RTGA, RNGA, RONGA, RTONGA, RIA), geelisse (RPG, RRG, RVIEF) või tahkefaasilisele kandjale (näiteks keha seintele). polüstüreenplaadi süvend, milles on fikseeritud üks immuunvastuse komponentidest - antigeen või antikeha). Tuntud on sellised tahkefaasilised meetodid nagu ELISA, IEM, RGadsTO, RIF, RGads, RTGads.

Sageli enamuse veres esinemise tõttu terved inimesed looduslikud viirusevastased antikehad, viirusinfektsioonide seroloogiline diagnoos põhineb uuringul paaris seerumid, võetud haiguse alguses ja kõrgpunktis või taastumisperioodil, et määrata antikehade tiitri suurenemist. Antikehade tiitri suurenemist neli või enam korda peetakse diagnostiliselt oluliseks.

Seroloogiliste meetodite tundlikkuse suurendamine saavutatakse antigeenide või antikehade adsorptsiooniga erütrotsüütidele (RNGA, RONGA, RTONGA, RGadsTO, RRG), mis on märgistatud ensüümidega (ELISA), radioaktiivsete isotoopidega (RIA, RPG) või fluorokroomidega (RIF). erütrotsüütide lüüsi meetodit kasutatakse ka (indikaatorsüsteemidena) antigeenide ja antikehade interaktsiooni ajal komplemendi (RSK, RRG) juuresolekul.

Komplemendi fikseerimise reaktsioon (CFR) komplemendi sidumise vormis külmas (öösel temperatuuril +4 0 C) kasutatakse viroloogias sageli mitmete viirusnakkuste retrospektiivseks diagnoosimiseks ja viirusspetsiifiliste antigeenide määramiseks patsientidelt saadud materjalides. .

Radiaalne hemolüüsi reaktsioon (RRH) agaroosgeelis põhineb antigeeniga sensibiliseeritud erütrotsüütide hemolüüsi nähtusel viirusspetsiifiliste antikehade mõjul komplemendi juuresolekul ning seda kasutatakse gripi, ARVI, punetiste, mumpsi ja togaviirusnakkuste seroloogiliseks diagnoosimiseks.

Reaktsiooni käivitamiseks lisatakse lamba erütrotsüütidele 0,1 ml lahjendamata viirusantigeeni (0,3 ml 10% suspensiooni) ja segu inkubeeritakse 10 minutit toatemperatuuril. 1,2% agaroosile lisatakse temperatuuril 42 0 C 0,3 ml sensibiliseeritud erütrotsüüte ja 0,1 ml komplementi, segu valatakse alusklaasidele või polüstüreenplaatide süvenditesse, külmutatud agaroosgeelist lõigatakse augud välja. mulgustada ja täita uuritud ja kontrollseerumiga. Klaasid või paneelid suletakse kaanega ja asetatakse 16-18 tunniks niiskesse kambrisse termostaadis. Reaktsiooni arvestamine toimub seerumiga täidetud aukude ümber paikneva hemolüüsi tsooni läbimõõdu järgi. Kontrollis hemolüüsi ei esine.

Enamusega viirusnakkused areneda immuunreaktsioonid kohta rakendatud diagnostika. Rakuvastuseid hinnatakse tavaliselt lümfotsüütide tsütotoksilisuse testides nakkusetekitajate või nendega nakatunud sihtrakkude suhtes või lümfotsüütide võimet reageerida erinevatele antigeenidele ja mitogeenidele. Praktiliste laborite töös määratakse rakuliste reaktsioonide raskusastet harva. Viirusevastaste AT-de tuvastamise meetodid on laiemalt levinud.

RN põhineb tsütopatogeense toime pärssimine pärast viiruse segamist spetsiifilise AT-ga. Tundmatu viirus segatakse teadaolevate kaubanduslike antiseerumitega ja viiakse pärast sobivat inkubeerimist raku monokihti. Rakusurma puudumine näitab mittevastavust nakkustekitaja ja teadaolevate antikehade vahel.

Hemaglutinatsiooni pärssimine

RTGA-d kasutatakse viiruste tuvastamiseks võimeline aglutineerima erinevaid erütrotsüüte. Selleks segatakse patogeeni sisaldav sööde tuntud kaubandusliku antiseerumiga ja viiakse rakukultuuri. Pärast inkubeerimist määratakse kultuuri hemaglutinatsioonivõime ja selle puudumisel tehakse järeldus viiruse ja antiseerumi mittevastavuse kohta.

Tsütopaatilise toime pärssimine viiruse sekkumise tõttu

Viiruste sekkumisest tingitud tsütopaatilise toime pärssimise reaktsioon kasutatakse patogeeni tuvastamiseks, mis häirib tuntud tsütopatogeenset viirust tundlike rakkude kultuuris. Selleks viiakse uuritud viirust sisaldavasse söötmesse kaubanduslik seerum (näiteks punetiste viiruse jaoks, kui seda kahtlustatakse), inkubeeritakse ja nakatatakse teine ​​kultuur; 1-2 päeva pärast sisestatakse sellesse teadaolev tsütopatogeenne viirus (näiteks mis tahes ECHO viirus). Tsütopatogeense toime olemasolul järeldatakse, et esimene kultuur oli nakatatud viirusega, mis vastab rakendatud AT-le.

Otsene immunofluorestsents

Muude testide hulgas on enim kasutatud otsene immunofluorestsentsreaktsioon(kõige kiirem, tundlikum ja reprodutseeritav). Näiteks CMV tuvastamine tsütopatogeense toime järgi nõuab vähemalt 2-3 nädalat ja märgistatud monoklonaalsete antikehade kasutamisel on identifitseerimine võimalik 24 tunni pärast.uurida fluorestsentsmikroskoopia abil (võimaldab tuvastada nakatunud rakkude fluorestsentsi olemasolu).

Immunoelektronmikroskoopia

Immunoelektronmikroskoopia(sarnaselt eelmisele meetodile) võimaldab tuvastada erinevat tüüpi elektronmikroskoopiaga tuvastatud viirused (näiteks erinevat tüüpi herpesviirused), mida morfoloogiliste tunnuste põhjal teha ei saa. Antiseerumite asemel kasutatakse identifitseerimiseks erineval viisil märgistatud AT-d, kuid meetodi keerukus ja kõrge hind piiravad selle rakendamist.

Enamik viirusinfektsioone arendab immuunvastuseid, mida kasutatakse diagnoosimiseks. Rakuvastuseid hinnatakse tavaliselt lümfotsüütide tsütotoksilisuse testides nakkusetekitajate või nakatunud sihtrakkude suhtes või lümfotsüütide võimet reageerida erinevatele antigeenidele ja mitogeenidele.

Praktiliste laborite töös määratakse rakuliste reaktsioonide raskusastet harva. Viirusevastaste AT-de tuvastamise meetodid on laiemalt levinud.

RN põhineb tsütopatogeense toime pärssimisel pärast viiruse segamist spetsiifiliste antikehadega. Tundmatu viirus segatakse teadaolevate kaubanduslike antiseerumitega ja viiakse pärast sobivat inkubeerimist raku monokihti. Rakusurma puudumine näitab mittevastavust nakkustekitaja ja teadaolevate antikehade vahel.

RTGA hemaglutinatsiooni pärssimine kasutatakse viiruste tuvastamiseks, mis on võimelised aglutineerima erinevaid erütrotsüüte. Selleks segatakse patogeeni sisaldav sööde tuntud kaubandusliku antiseerumiga ja viiakse rakukultuuri. Pärast inkubeerimist määratakse kultuuri hemaglutinatsioonivõime ja selle puudumisel tehakse järeldus viiruse ja antiseerumi mittevastavuse kohta. Tsütopaatilise toime pärssimine viiruse interferentsiga Tsütopaatilise toime pärssimise reaktsiooni viiruste sekkumisest kasutatakse patogeeni tuvastamiseks, mis häirib tundlike rakkude kultuuris teadaolevat tsütopatogeenset viirust. Selleks viiakse uuritud viirust sisaldavasse söötmesse kaubanduslik seerum (näiteks punetiste viiruse jaoks, kui seda kahtlustatakse), inkubeeritakse ja nakatatakse teine ​​kultuur; 1-2 päeva pärast sisestatakse sellesse teadaolev tsütopatogeenne viirus (näiteks mis tahes ECHO viirus). Kui on olemas tsütopatogeenne toime, järeldatakse, et esimene kultuur oli nakatunud viirusega, mis vastab rakendatud AT-le.

Otsene immunofluorestsents.

Teiste testide hulgas on suurima jaotuse leidnud otsene immunofluorestsentsreaktsioon (kõige kiirem, tundlikum ja reprodutseeritav). Näiteks CMV tuvastamine tsütopatogeense toime järgi nõuab vähemalt 2-3 nädalat ja märgistatud monoklonaalsete antikehade kasutamisel on tuvastamine võimalik 24 tunni pärast.fluorestsentsmikroskoopia abil (võimaldab tuvastada nakatunud rakkude fluorestsentsi olemasolu).

Immunoelektronmikroskoopia (sarnaselt eelmisele meetodile) võimaldab tuvastada elektronmikroskoopia abil tuvastatud erinevat tüüpi viirusi (näiteks erinevat tüüpi herpesviirused), mida morfoloogiliste tunnuste põhjal teha ei saa. Antiseerumite asemel kasutatakse identifitseerimiseks erineval viisil märgistatud AT-d, kuid meetodi keerukus ja kõrge hind piiravad selle rakendamist.

Viirusevastaste antikehade (AT) tuvastamine vereseerumis. RTGA. RSK. REEF.

Immunosorptiivsed meetodid viirusevastaste antikehade tuvastamiseks.

Lihtsam ja kättesaadavam meetod on viirusevastaste antikehade (AT) tuvastamine seerumis. Vereproove tuleb võtta kaks korda: kohe pärast haiguse algust kliinilised tunnused ja 2-3 nädala pärast. Äärmiselt oluline on uurida täpselt kahte seerumiproovi. Üksiku uuringu tulemusi ei saa pidada lõplikuks, kuna AT ilmnemist ei ole võimalik käesoleva juhtumiga seostada. Võimalik, et need antikehad ringlevad pärast eelmist nakatumist. Sellises olukorras on raske taastumisperioodil saadud seerumi uuringu rolli üle hinnata. Haiguse esinemisele esimese proovi võtmise perioodil viitab AT tiitri vähemalt neljakordne tõus, mis tuvastati teise proovi uuringu käigus.

Allpool loetletud meetodid ei võimalda eristada haiguse ajal tekkinud ja pärast paranemist ringlevaid antikehi (selle perioodi kestus on erinevate infektsioonide puhul erinev). Kuna adekvaatse diagnoosi jaoks on vaja kinnitada AT tiitrite olulist suurenemist kahes proovis, uuritakse esimest proovi ägedas faasis ja teist - taastumisperioodil (2-3 nädala pärast). Saadud tulemused on retrospektiivsed ja sobivad paremini epidemioloogilisteks uuringuteks. RTGA tuvastab viiruste (näiteks gripiviiruse) hemaglutiniinide vastu sünteesitud antikehad.

Meetod muudab selliste antikehade (AT) tuvastamise patsiendi seerumis lihtsaks. RSK on viirusnakkuste serodiagnostika peamine meetod (saadaolevate meetodite hulgas). Reaktsioon tuvastab komplementi fikseerivad IgM ja IgG, kuid ei erista neid; saadud tulemuste optimeerimiseks nõuab reaktsiooni formuleerimine personali teatud oskusi.

REEF. Kui on olemas nakatunud koe biopsia ja müügil olevad fluorestseiiniga märgistatud AT komplektid, võib diagnoosi kinnitada otsene immunofluorestsents.

Reaktsiooni formuleerimine hõlmab uuritud koe inkubeerimist AT-ga, nende järgnevat eemaldamist ja proovi fluorestsentsmikroskoopiat. Immunosorptiivsed meetodid viirusevastaste antikehade tuvastamiseks Immunosorptiivsed meetodid (näiteks ELISA ja RIA) on informatiivsemad, kuna need tuvastavad IgM ja IgG eraldi, mis võimaldab teha teatud järeldusi nakkusprotsessi dünaamika või taastumisseisundi kohta. AT tuvastamiseks adsorbeeritakse tuntud antigeen tahkele substraadile (näiteks katseklaaside seintele, plastikust mikroplaatidele, Petri tassidele) ja lisatakse patsiendi seerumi erinevaid lahjendusi. Pärast sobivat inkubeerimist eemaldatakse seondumata AT-d, lisatakse ensüümiga märgistatud inimese Ig vastane antiseerum, seondumata AT-de inkubeerimise ja pesemise protseduuri korratakse ning lisatakse mis tahes kromogeenne substraat (ensüümi toime suhtes tundlik). Kuna värvimuutus on võrdeline spetsiifiliste antikehade sisaldusega, on nende tiitrit võimalik spektrofotomeetrilise meetodiga määrata. HIV-nakkuse diagnoosimisel on suurima leviku leidnud immunoblotanalüüs.

Viiruse antigeenide (AH) tuvastamine. ELISA. Praegu on mõnede patogeenide AH tuvastamiseks juba ilmunud kaubanduslikud komplektid, mis võimaldavad neid tuvastada 5-10 minuti jooksul. AG tuvastamiseks tahkel faasil adsorbeeritakse tuntud AT ja lisatakse AG-d sisaldav seerum; pärast inkubeerimist dekanteeritakse seondumata AG, süsteem pestakse ja lisatakse adsorbeeritud antikehadele spetsiifilised märgistatud antikehad. Korrake inkubeerimise ja pesemise protseduuri, tehke kromogeenne substraat, positiivne tulemus fikseeritud, kui süsteemi värv muutub. DNA hübridisatsioon on väga spetsiifiline meetod, mis võimaldab tuvastada viiruse genoomi pärast selle hübridiseerimist komplementaarsete DNA molekulidega. Markeritena kasutatakse ensüüme ja isotoope.

Meetod määrab viiruse DNA võime hübridiseeruda märgistatud komplementaarse DNA-ga; meetodi spetsiifilisus on otseselt võrdeline komplementaarse ahela pikkusega. Paljutõotav meetod nukleiinhapete in situ hübridiseerimiseks. Reaktsiooni käivitamiseks kantakse märgistatud DNA koebiopsiatele (sealhulgas need, mis on fikseeritud formaliiniga või sisestatud parafiiniplokkidesse) ja registreeritakse interaktsioon komplementaarse DNA-ga. Meetodit kasutatakse herpes simplex viiruste, inimese papilloomi, Epstein-Barri jne tuvastamiseks.

PCR. Meetod suurendab oluliselt hübridisatsioonimeetodi tundlikkust, suurendades viiruse DNA sisaldust patsiendilt saadud materjalis ning kiirendab ka tulemuse saamise aega.