Metode de diagnostic de laborator al infecțiilor virale. Teste serologice Teste serologice utilizate pentru diagnostic

Diagnosticul serologic bazat pe reacția antigen-anticorp poate fi utilizat pentru a determina ambele și joacă un rol în determinarea etiologiei unei infecții virale chiar și cu rezultate negative ale izolării virusului.

Succesul diagnosticului serologic depinde de specificul reacției și de respectarea condițiilor temporare de prelevare a sângelui necesare sintezei de anticorpi de către organism.

În cele mai multe cazuri, se folosesc seruri de sânge pereche, luate la intervale de 2-3 săptămâni. O reacție pozitivă este considerată o creștere de cel puțin 4 ori a titrului de anticorpi. Se știe că majoritatea anticorpilor specifici aparțin claselor IgG și IgM, care sunt sintetizați în momente diferite ale procesului infecțios. în care anticorpi IgM sunt precoce, iar testele folosite pentru a le determina sunt folosite pentru diagnosticul precoce (este suficient să examinăm un ser). Anticorpii din clasa IgG sunt sintetizați mai târziu și stocați pentru o perioadă lungă de timp.

Pentru tiparea virusului, pH-ul este utilizat, pentru diagnosticarea specifică grupului, de exemplu, a infecției cu adenovirus, se utilizează reacție de fixare a complementului(RSK). Cele mai folosite sunt reacție de inhibare a hemaglutinării(RTGA), RSK, RIF, reacții pasiveși hemaglutinare pasivă inversă(RPGA, ROPGA), diverse variante ale ELISA, care aproape peste tot au înlocuit RIA, egale ca sensibilitate la acesta.

RTGA folosit pentru diagnosticarea bolilor cauzate de virusurile hemaglutinante. Se bazează pe legarea anticorpilor la serul pacientului a virusului standard adăugat. Indicatorul de reacție sunt eritrocitele aglutinate de virus (formarea unei „umbrele” caracteristice) în absența anticorpilor specifici și care se depun la fund, neaglutinate dacă sunt prezenți.

RSK este unul dintre testele serologice tradiționale și este folosit pentru a diagnostica multe infecții virale. Două sisteme iau parte la reacție: anticorpi din serul pacientului + virus standard și eritrocite de oaie + anticorpi la acestea, precum și un complement titrat. Dacă anticorpii și virusul se potrivesc, acest complex leagă complementul și nu are loc liza eritrocitelor de oaie ( reacție pozitivă). Cu un RSC negativ, complementul contribuie la liza eritrocitelor. Dezavantajul metodei este sensibilitatea insuficient de mare și dificultatea standardizării reactivilor.

Pentru a ține cont de semnificația RSK, precum și a RTGA, este necesar să se titraze serurile pereche, adică luate la debutul bolii și în timpul convalescenței.

RPGA- aglutinarea eritrocitelor (sau bilele de polistiren) sensibilizate de antigeni virali in prezenta anticorpilor. Orice virus poate fi absorbit pe eritrocite, indiferent de prezența sau absența activității hemaglutinante în ele. Datorită prezenței reacțiilor nespecifice, serurile sunt testate la o diluție de 1:10 sau mai mult.

RNGA- aglutinarea eritrocitelor sensibilizate de anticorpi specifici in prezenta antigenelor virale. ROPHA a primit cea mai mare distribuție în detectarea antigenului HBs atât la pacienți, cât și la donatorii de sânge.

DACĂ metoda de asemenea ELISA utilizat pentru detectarea anticorpilor în ser. ELISA în scopuri de diagnostic devine din ce în ce mai importantă și răspândită. Antigenul viral este absorbit pe faza solidă (fundul godeurilor plăcilor de polistiren sau granule de polistiren). Când se adaugă anticorpii corespunzători în ser, aceștia se leagă de antigenele adsorbite. Prezența anticorpilor doriti este detectată folosind anti-anticorpi (de exemplu, umani) conjugați cu o enzimă (peroxidază). Adăugarea substratului și reacția substrat-enzimă dau culoare. ELISA poate fi, de asemenea, utilizat pentru determinarea antigenelor. În acest caz, anticorpii sunt adsorbiți pe faza solidă.

Anticorpi monoclonali. Progrese mari în diagnosticarea infecţiilor virale s-au înregistrat în ultimul deceniu, când, odată cu dezvoltarea cercetării ingineriei genetice, a fost dezvoltat un sistem de obţinere a anticorpilor monoclonali. Acest lucru a crescut dramatic specificitatea și sensibilitatea metode de diagnostic determinarea antigenelor virale. Specificitatea îngustă a monoclonelor, reprezentând o proporție mică de proteine ​​virale care ar putea să nu fie prezente în materialul clinic, este depășită cu succes prin utilizarea mai multor anticorpi monoclonali la diverși determinanți virali.

Se bazează pe determinarea anticorpilor antivirali în sângele pacientului în reacții serologice folosind antigene virale specifice - diagnosticums sau sisteme speciale de testare. Reacțiile serologice în infecțiile virale se pun într-un mediu lichid (RSK, RTGA, RNGA, RONGA, RTONGA, RIA), într-un gel (RPG, RRG, RVIEF) sau pe un purtător în fază solidă (de exemplu, pe pereții un godeu al unei plăci de polistiren cu fixarea uneia dintre componentele răspunsului imun – antigen sau anticorp). Sunt cunoscute metode în fază solidă precum ELISA, IEM, RGadsTO, RIF, RGads, RTGads.

Adesea, din cauza prezenței în sânge a majorității oameni sanatosi anticorpi antivirali naturali, diagnosticul serologic al infecțiilor virale se bazează pe studiu seruri asociate, luate la începutul şi la apogeul bolii sau în perioada de convalescenţă pentru a determina creşterea titrului de anticorpi. O creștere a titrului de anticorpi de patru ori sau mai mult este considerată semnificativă din punct de vedere diagnostic.

Creșterea sensibilității metodelor serologice se realizează prin adsorbția de antigene sau anticorpi pe eritrocite (RNGA, RONGA, RTONGA, RGadsTO, RRG), marcate cu enzime (ELISA), izotopi radioactivi (RIA, RPG) sau fluorocromi (RIF), Principiul a lizei eritrocitelor se mai folosește (ca sisteme indicator) în timpul interacțiunii antigenelor și anticorpilor în prezența complementului (RSK, RRG).

Reacția de fixare a complementului (CFR) sub formă de fixare a complementului la frig (în timpul nopții la o temperatură de +4 0 C) este adesea folosit în virologie pentru diagnosticarea retrospectivă a unui număr de infecții virale și pentru determinarea antigenelor specifice virusului în materiale de la pacienți. .

Reacția de hemoliză radială (RRH)în gel de agaroză se bazează pe fenomenul de hemoliză a eritrocitelor sensibilizate de un antigen sub influența anticorpilor specifici virusului în prezența complementului și este utilizat pentru diagnosticul serologic al infecțiilor gripale, SARS, rubeolă, oreion și togavirus.

Pentru a stabili reacția, se adaugă 0,1 ml de antigen viral nediluat la eritrocitele de oaie (0,3 ml dintr-o suspensie 10%) și amestecul este incubat timp de 10 minute la temperatura camerei. Se adaugă 0,3 ml eritrocite sensibilizate și 0,1 ml complement la 1,2% agaroză la o temperatură de 42 0 C, amestecul se toarnă pe lame de sticlă sau în godeurile plăcilor de polistiren, se decupează găurile în gelul de agaroză congelat cu un pumn și umplut cu serurile studiate și de control. Paharele sau panourile se închid cu un capac și se pun într-o cameră umedă timp de 16-18 ore într-un termostat. Contabilitatea reacției se efectuează în funcție de diametrul zonei de hemoliză din jurul găurilor umplute cu ser. Nu există hemoliză în control.

Cu majoritatea infecții virale dezvolta reacții imune aplicat diagnostice. Răspunsurile celulare sunt de obicei evaluate în teste de citotoxicitate limfocitelor împotriva agenților infecțioși sau a celulelor țintă infectate de aceștia sau a capacității limfocitelor de a răspunde la diverși antigeni și mitogeni. În munca laboratoarelor practice, severitatea reacțiilor celulare este rareori determinată. Metodele de identificare a AT antivirale au devenit mai răspândite.

RN se bazează pe suprimarea efectului citopatogen după amestecarea virusului cu AT specific. Virusul necunoscut este amestecat cu antiseruri comerciale cunoscute și, după incubarea corespunzătoare, introdus în monostratul celular. Absența morții celulare indică o nepotrivire între agentul infecțios și anticorpii cunoscuți.

Inhibarea hemaglutinarii

RTGA este folosit pentru a identifica viruși capabil de a aglutina diferite eritrocite. Pentru a face acest lucru, mediul de cultură care conține agentul patogen este amestecat cu un antiser comercial cunoscut și introdus în cultura celulară. După incubare, se determină capacitatea de hemaglutinare a culturii și, în absența acesteia, se face o concluzie despre nepotrivirea virusului cu antiserul.

Inhibarea efectului citopatic prin interferența virusului

Reacția de inhibare a efectului citopatic datorită interferenței virusurilor utilizat pentru a identifica un agent patogen care interferează cu un virus citopatogen cunoscut într-o cultură de celule sensibile. Pentru a face acest lucru, un ser comercial (de exemplu, la virusul rubeolei dacă este suspectat) este introdus în mediul de cultură care conține virusul studiat, incubat și infectează a doua cultură; după 1-2 zile, se introduce în el un virus citopatogen cunoscut (de exemplu, orice virus ECHO). În prezența unui efect citopatogen, se ajunge la concluzia că prima cultură a fost infectată cu un virus corespunzător AT aplicată.

Imunofluorescență directă

Printre alte teste, cel mai utilizat reacție directă de imunofluorescență(cel mai rapid, mai sensibil și reproductibil). De exemplu, identificarea CMV prin efectul său citopatogen necesită cel puțin 2-3 săptămâni, iar atunci când se folosesc anticorpi monoclonali marcați, identificarea este posibilă după 24 de ore.examinați folosind microscopia fluorescentă (vă permite să detectați prezența fluorescenței celulelor infectate) .

Microscopia imunoelectronică

Microscopia imunoelectronică(similar cu metoda anterioară) vă permite să identificați tipuri diferite viruși detectați prin microscopie electronică (de exemplu, diferite tipuri de herpesvirusuri), care nu se pot realiza pe baza caracteristicilor morfologice. În loc de antiseruri, AT etichetat în diferite moduri sunt folosite pentru identificare, dar complexitatea și costul ridicat al metodei limitează aplicarea acesteia.

Majoritatea infecțiilor virale dezvoltă răspunsuri imune care sunt utilizate pentru diagnostic. Răspunsurile celulare sunt de obicei evaluate în teste de citotoxicitate limfocitelor împotriva agenților infecțioși sau a celulelor țintă infectate de aceștia sau a capacității limfocitelor de a răspunde la diverși antigeni și mitogeni.

În munca laboratoarelor practice, severitatea reacțiilor celulare este rareori determinată. Metodele de identificare a AT antivirale au devenit mai răspândite.

RN bazat pe suprimarea efectului citopatogen după amestecarea virusului cu anticorpi specifici. Virusul necunoscut este amestecat cu antiseruri comerciale cunoscute și, după incubarea corespunzătoare, introdus în monostratul celular. Absența morții celulare indică o nepotrivire între agentul infecțios și anticorpii cunoscuți.

Inhibarea hemaglutinării RTGA folosit pentru identificarea virusurilor capabile să aglutine diferite eritrocite. Pentru a face acest lucru, mediul de cultură care conține agentul patogen este amestecat cu un antiser comercial cunoscut și introdus în cultura celulară. După incubare, se determină capacitatea de hemaglutinare a culturii și, în absența acesteia, se face o concluzie despre nepotrivirea virusului cu antiserul. Inhibarea efectului citopatic prin interferența virală Reacția de inhibare a efectului citopatic datorită interferenței virusurilor este utilizată pentru a identifica un agent patogen care interferează cu un virus citopatogen cunoscut într-o cultură de celule susceptibile. Pentru a face acest lucru, un ser comercial (de exemplu, la virusul rubeolei dacă este suspectat) este introdus în mediul de cultură care conține virusul studiat, incubat și infectează a doua cultură; după 1-2 zile, se introduce în el un virus citopatogen cunoscut (de exemplu, orice virus ECHO). Dacă există un efect citopatogen, se ajunge la concluzia că prima cultură a fost infectată cu virusul corespunzător AT-ului aplicat.

Imunofluorescență directă.

Printre alte teste, reacția de imunofluorescență directă (cea mai rapidă, mai sensibilă și reproductibilă) a găsit cea mai mare distribuție. De exemplu, identificarea CMV prin efect citopatogen necesită cel puțin 2-3 săptămâni, iar la utilizarea anticorpilor monoclonali marcați, identificarea este posibilă după 24 de ore.folosind microscopie fluorescentă (vă permite să detectați prezența fluorescenței celulelor infectate).

Microscopia imunoelectronică (asemănător cu metoda anterioară) vă permite să identificați diferite tipuri de viruși detectați prin microscopie electronică (de exemplu, diferite tipuri de herpesvirusuri), ceea ce nu se poate face pe baza caracteristicilor morfologice. În loc de antiseruri, AT etichetat în diferite moduri sunt folosite pentru identificare, dar complexitatea și costul ridicat al metodei limitează aplicarea acesteia.

Detectarea anticorpilor antivirali (AT) în serul sanguin. RTGA. RSK. RECIF.

Metode imunosorbtive pentru detectarea anticorpilor antivirali.

O abordare mai simplă și mai accesibilă este detectarea anticorpilor antivirali (AT) în ser. Probele de sânge trebuie luate de două ori: imediat după debutul semne clinice si dupa 2~3 saptamani. Este extrem de important să examinăm exact două probe de ser. Rezultatele unui singur studiu nu pot fi considerate concludente din cauza incapacității de a lega apariția AT cu cazul de față. Este posibil ca acești anticorpi să circule după o infecție anterioară. Într-o asemenea situație, rolul studiului serului obținut în perioada de convalescență poate fi cu greu supraestimat. Prezența bolii în perioada de prelevare a primei probe este indicată de o creștere de cel puțin patru ori a titrului AT, care a fost detectată în timpul studiului celei de-a doua probe.

Metodele enumerate mai jos nu permit diferențierea anticorpilor (AT) formați în timpul bolii și care circulă după recuperare (durata acestei perioade este variabilă pentru diferite infecții). Deoarece pentru un diagnostic adecvat este necesar să se confirme o creștere semnificativă a titrurilor AT în două probe, prima probă este examinată în faza acută, iar a doua - în perioada de recuperare (după 2-3 săptămâni). Rezultatele obţinute sunt retrospective şi mai potrivite pentru anchetele epidemiologice. RTGA detectează anticorpii sintetizați împotriva hemaglutininelor virusurilor (de exemplu, virusul gripal).

Metoda facilitează detectarea unor astfel de anticorpi (AT) în serul pacientului. RSK este principala metodă de serodiagnostic a infecțiilor virale (dintre cele disponibile). Reacția detectează IgM și IgG care fixează complementul, dar nu le diferențiază; pentru optimizarea rezultatelor obţinute, formularea reacţiei necesită anumite aptitudini ale personalului.

RECIF. Dacă este disponibilă o biopsie a țesutului infectat și sunt disponibile truse AT comerciale marcate cu fluoresceină, imunofluorescența directă poate confirma diagnosticul.

Formularea reacției include incubarea țesutului studiat cu AT, îndepărtarea ulterioară a acestora și microscopia fluorescentă a probei. Metode de imunosorbție pentru detectarea anticorpilor antivirali Metodele de imunosorbție (de exemplu, ELISA și RIA) sunt mai informative, deoarece detectează IgM și IgG separat, ceea ce face posibilă tragerea anumitor concluzii despre dinamica procesului infecțios sau starea de convalescență. Pentru a detecta AT, un antigen cunoscut este adsorbit pe un substrat solid (de exemplu, pe pereții eprubetelor, microplăci de plastic, vase Petri) și se adaugă diferite diluții ale serului pacientului. După incubarea corespunzătoare, AT nelegate sunt îndepărtate, se adaugă antiser marcat cu enzimă împotriva Ig-ului uman, se repetă procedura de incubare și spălarea AT nelegate și se adaugă orice substrat cromogen (sensibil la acțiunea enzimei). Deoarece schimbarea culorii este proporțională cu conținutul de anticorpi specifici, este foarte posibil să se determine titrul acestora prin metoda spectrofotometrică. În diagnosticul infecției cu HIV, metoda imunoblotării a găsit cea mai mare distribuție.

Detectarea antigenelor virale (AH). ELISA. În prezent, au apărut deja truse comerciale pentru detectarea AH a unor agenți patogeni, permițând identificarea acestora în 5-10 minute. Pentru a detecta AG pe faza solidă, AT cunoscute sunt adsorbite și se adaugă ser care conține AG; după incubare, AG nelegat este decantat, sistemul este spălat și se adaugă anticorpi marcați specifici anticorpilor adsorbiți. Repetați procedura de incubare și spălare, faceți un substrat cromogen, rezultat pozitiv fixat atunci când culoarea sistemului se schimbă. Hibridizarea ADN-ului este o metodă foarte specifică care permite identificarea genomului virusului după hibridizarea acestuia cu molecule de ADN complementare. Enzimele și izotopii sunt utilizați ca markeri.

Metoda determină capacitatea ADN-ului viral de a hibridiza cu ADN-ul complementar marcat; specificitatea metodei este direct proporţională cu lungimea lanţului complementar. O metodă promițătoare pentru hibridizarea in situ a acizilor nucleici. Pentru a stabili reacția, ADN-ul marcat este aplicat biopsiilor de țesut (inclusiv cele fixate cu formol sau închise în blocuri de parafină) și se înregistrează interacțiunea cu ADN-ul complementar. Metoda este folosită pentru a detecta virusurile herpes simplex, papilomul uman, Epstein-Barr etc.

PCR. Metoda crește semnificativ sensibilitatea metodei de hibridizare, crescând conținutul de ADN viral în materialul obținut de la pacient și, de asemenea, accelerează timpul de obținere a rezultatului.